再生医療用網膜組織の機能を担保した冷却保存方法の開発

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K21633
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 小出 直史 国立研究開発法人理化学研究所, 多細胞システム形成研究センター, 研究員 (40714126)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 細胞保存 / 不凍タンパク質 / 再生医療 / 蛍光異方性 / RPE / 網膜組織

Outline of Annual Research Achievements

臨床研究等に資する細胞製剤を製造する上で、細胞機能を担保した保存技術の開発は不可欠である。現状臨床用細胞では細胞ラベル等の修飾を施すことは容易ではないが、基盤技術開発ではその制限が少ないため本研究では細胞機能をモニタリングする技術として、蛍光タンパク質の蛍光異方性に着目した。細胞機能あるいは純度を規定するタンパク質にマーカータンパク質をノックインした細胞を用いてPOC取得に取り組んだ。蛍光タンパク質溶液では検量線を描くことができたが、細胞内タンパク質の発現量では蛍光タンパク質の量的問題と立体網膜の形状、厚みの問題から線形関係を定量するに至っていない。検出系の改良を主軸に課題解決を図っている。
また、不凍タンパク質を用いた細胞保存技術については、昨年度課題になった不凍タンパク質の溶解度の問題を解決し、NIH3T3等の細胞株を用いて冷蔵環境下における不凍タンパク質の細胞保護効果について検証した。その結果、Control群（無処理）やBSA添加群と比較してIII型AFP添加群において顕著に細胞生存室の維持が観察された。今後、RPEやRPEシート等の再生医療等製品などで検証を重ね、細胞生存率のみならず細胞機能（蛍光異方性だけでなく分泌タンパク質の定量や貪食能等も）にも焦点を当てて評価を継続したい。
他方、「他家iPS細胞由来RPE細胞懸濁液移植に関する臨床研究」において製造施設と医療施設間を輸送することが求められたため、本課題に関連して細胞保存条件の検証を行った。生物由来原料基準等の背景から不凍タンパク質は採用できなかったが、温度に関する検証は先行して検証し、輸送温度や細胞形態等に関する課題を克服した輸送技術を確立し臨床研究で採用するに至った。
本課題ではさらなる技術開発を通して、冷却保存を用いて安定した長期的細胞保存技術の開発を進める。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

【蛍光異方性と細胞機能評価】
蛍光異方性と細胞機能を関連づけるために、細胞機能あるいは純度を規定するタンパク質にマーカータンパク質をノックインした細胞を用いてPOC取得に取り組んだ。蛍光タンパク質溶液では検量線を描くことができたが、細胞内タンパク質の発現量では蛍光タンパク質の量的問題と立体網膜の形状、厚みの問題から線形関係を定量するに至っていない。検出系の改良を主軸に課題解決を図っている。
【不凍タンパク質の細胞保護効果】
不凍タンパク質を用いた検証については、これまで溶解性の課題を不凍タンパク質の純化・精製工程の改良と見直しを通して、克服することに成功した。そして、冷蔵環境下における不凍タンパク質の保護効果について細胞を用いた評価に至っている。NIH3T3等の細胞株を用いて冷蔵環境下における不凍タンパク質の細胞保護効果について検証した。その結果、Control群（無処理）やBSA添加群と比較してIII型AFP添加群において顕著に細胞生存率の維持が観察された。今年度は細胞種を再生医療等製品であるRPEやRPEシート等を用いて評価を継続させる。そして細胞生存のみならず細胞機能について言及できるようにデータを積み重ねる予定である。

Strategy for Future Research Activity

【蛍光異方性と細胞機能評価】
蛍光タンパク質溶液では検量線を描くことができたが、細胞内タンパク質の発現量では蛍光タンパク質の量的問題と立体網膜の形状、厚みの問題から線形関係を定量するに至っていない。検出系の改良を主軸に課題解決を図る。
【不凍タンパク質の細胞保護効果】
不凍タンパク質を用いた検証については、これまでに溶解性の課題を克服し冷蔵環境下における不凍タンパク質の保護効果について細胞を用いた評価に至っている。今年度は細胞種を再生医療等製品であるRPEやRPEシート等を用いて評価を継続させる。RPEは細胞機能を評価する方法として、分泌タンパクの定量、細胞貪食能、経上皮抵抗（TER; RPEシートのみ）等が確立しているため、蛍光異方性の機能評価系を客観的に評価することも可能となる。これらを通して細胞生存のみならず細胞機能について言及できるようにデータを積み重ねる予定である。

Causes of Carryover

次年度は蛍光異方性を用いた細胞内機能タンパクの定量を目指して検出系（プレートリーダーの改造等）の改善を図るとともに、不凍タンパク質を用いた冷蔵環境下における細胞保護効果の詳細検討を実施する。不凍タンパク質の細胞保護効果を検討するにあたり、立体網膜組織に加え、再生医療等製品として実用化ニーズの高いRPE細胞懸濁液とRPEシートを対象細胞として加えることとした。RPEは細胞機能を確認する品質管理の系（分泌タンパク質の定量、貪食能等）が確立しており、保存条件暴露前後の細胞生存率や細胞機能をモニタリングすることで不凍タンパク質の細胞保護効果を検証する。また、細胞機能をモニタリングできることから蛍光異方性の系の検証にもフィードバックすることが可能である。一方、RPEの機能タンパク質を評価するためのラベル細胞が手元にないため、機能タンパク質をラベルするための細胞を準備することを予定している。まとめると、１）細胞蛍光タンパク質による蛍光異方性の検出手法の確立、２）RPE懸濁液、RPEシートを用いた不凍タンパク質の細胞保護効果の検証、３）RPE機能タンパク質のノックイン細胞の樹立、これらを遂行する予定である。