2017 Fiscal Year Research-status Report
酵素活性中心の構造変化とゆらぎにリンクする触媒反応遷移状態の制御機構
| Project/Area Number |
16KT0055
|
|---|
| Research Institution | Osaka University |
|---|
Principal Investigator |
岡島 俊英 大阪大学, 産業科学研究所, 准教授 (10247968)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中井 忠志 広島工業大学, 生命学部, 准教授 (00333344)
庄司 光男 筑波大学, 計算科学研究センター, 助教 (00593550)
村川 武志 大阪医科大学, 医学部, 助教 (90445990)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-07-19 – 2019-03-31
|
| Keywords | 遷移状態 / ゆらぎ / 銅アミン酸化酵素 / 補酵素 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、細菌由来の銅アミン酸化酵素(AGAO)を用いて、反応促進に特化したタンパク質がもつ動的な特性が、反応の遷移状態の安定化にどのように寄与しているのか明らかにする点にある。実験的にAGAOの水素原子座標を決定し、量子化学計算に用いるために、昨年度の反応初期状態の酸化型酵素の中性子構造解析についで、今年度は反応中間体であるセミキノンラジカル反応中間体の解析を進めた。大型結晶の嫌気的な条件下における基質ソーキング（pD 9）の最適化を行い、その結果、テスト測定において1.55オングストローム分解能の回折イメージを得た。調製した結晶は液体窒素中に保存してあり、ビームタイムを配分された平成30年４月にフルセットデータを取得する予定である。
前年度の酸化型酵素の中性子構造をもとに、さらに量子科学計算を用いた解析を進めた結果、TPQのNH-π相互作用しているAsn381側鎖がFlippingしており、アミド基の向きに関して大きなゆらぎが存在していることがわかった。これは中性子構造における核密度マップからわかる水素原子位置からも明確であった。また、銅イオンに配位したHis431残基側鎖イミダゾール基についても、興味深いことがわかった。すなわち、銅イオンに配位した3つのHis残基のうち，His431のイミダゾール窒素に結合したプロトンの核密度が検出されなかった。このためHis431については，金属イオンの配位によりイミダゾール基のpKaが低下し，anion型を取っているとアサインされた．このような金属イオンの効果はMetal-induced histidine deprotonationとよばれ、金属酵素の触媒機構の一つとして提案されてきた。しかし、赤外分光やラマン分光などで示唆するデータはあるが、あまり詳細な研究はされておらず、本研究が最初の構造的な知見となった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
銅アミン酸化酵素のセミキノンラジカル反応中間体の中性子構造解析は、ラジカル状態としての解析として世界に先駆けた極めて重要な成果である。中性子ビームラインのビームタイム配分が遅れ、やや予定通りに進展していない面もあるが、概ね予定通りである。また、量子化学的な計算によって遷移状態を解析する課題に関しても、反応開始状態である酸化型においてプロトン化状態を決定する手順を確立することができており、反応中間体状態へアプローチすることが可能となった。以上のことから、概ね順調な進捗状況と評価できる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
他の反応中間体、あるいはプロトン化状態を解析するためにpHを変えた構造の中性子構造解析についても解析を進める。加えて、量子化学計算においては、基質シッフ塩基反応中間体からのプロトン引き抜きについて、ゆらぎの関わりの解析を進める。
|
| Causes of Carryover |
年度末に論文投稿を予定していたが、想定していたより若干遅れがあり、次年度に持ち越したため差額が生じた。初年度の持ち越し金額と大きな差はなく、当該年度の使用金額としては、ほぼ想定通りであった。翌年度の前半を目標に、論文投稿を急ぎたい。
|
