中性子ビームを利用した酵素反応中間体の結晶構造解析

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16KT0063
• Research Institution: National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology
• Principal Investigator: 安達 基泰 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 高崎量子応用研究所 東海量子ビーム応用研究センター, 上席研究員(定常) (60293958)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 森元 聡 九州大学, 薬学研究院, 教授 (60191045) ; 老川 典夫 関西大学, 化学生命工学部, 教授 (80233005) ; 木下 誉富 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (90405340)
• Project Period (FY): 2016-07-19 – 2020-03-31
• Keywords: 酵素 / 結晶構造解析 / 中性子

Outline of Annual Research Achievements

酵素(タンパク質)は、高度に進化した分子認識能とダイナミクスによって、複雑な骨格や多様な官能基を有する生理活性物質を効果的に合成する分子である。酵素の触媒機構の解明は、生命科学研究の発展と深く関わるだけでなく、複雑な化学構造をもった有用化合物を効率よく合成する産業技術の開発にも繋がる。本提案では、学術・産業の両面から有用な生合成経路を担うモデル酵素を研究対象として選択し、その反応中間体や遷移状態アナログ複合体の中性子結晶構造解析により、酵素の複雑で巧妙な反応触媒機構を解明する。また得られた知見を有用化合物の創製に資することを目的とする。
(i) 植物二次代謝化合物合成酵素の反応機構の解明に向けて、ポリケタイド合成酵素(PKS)の反応中間体の捕捉に注力して研究をすすめた。既に当該酵素のX線結晶構造を決定しているが、中性子利用研究で鍵となるPKSの高効率での調製系の確立に取り組んだ。PKSは大腸菌による高発現が可能であるが多くは不溶性タンパク質として発現する。また、触媒基の一つであるCys残基が容易に酸化され失活するので、迅速な精製方法の確立が必要となる。本年度は、HisTag配列の見直しを実施し、発現コンストラクトを確定した。
(ii)アミノ酸ラセマーゼやアミラーゼ両酵素について、大量調製系の確立に成功した。そのうちアミノ酸ラセマーゼに関しては、1.0Å分解能のX線結晶構造解析に成功した。
(iii) 創薬標的酵素においては、野生型およびE166A変異型βラクタマーゼ、Ser/Thrキナーゼに関して試料調製と大型結晶作製を実施した。阻害剤複合体の中性子解析に向けて複合体結晶作製のための条件検討を実施した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究での成果創出のためには、安定な試料調製系の確立と、高分解能な解析が可能な結晶の作製が鍵となる。研究対象とするほぼすべての酵素に関して、それらが達成され、今後の取り組みの土台作りができた。

Strategy for Future Research Activity

(i) 植物二次代謝化合物合成酵素の反応機構の解明に向けて、PKSの反応中間体の捕捉に注力する。PKSに関しては、触媒基の一つであるCys残基が容易に酸化され失活するので、溶存酸素を完全に除去した嫌気条件での精製・結晶化実験を実施する。
(ii)アミノ酸ラセマーゼやアミラーゼ両酵素については、中性子構造解析実現のための準備として、Ｘ線結晶構造解析による反応中間体の捕捉条件を検討する。
(iii) 創薬標的酵素においては、野生型およびE166A変異型βラクタマーゼ、Ser/Thrキナーゼを引き続き対象とする。反応中間体の中性子解析の実現に向けてさらに条件検討をすすめる。

Causes of Carryover

放射光実験のビームタイムに合わせて、試料調製実験の一部を次年度に延期した。

Expenditure Plan for Carryover Budget

実験用消耗品の購入に使用する。