2017 Fiscal Year Research-status Report
中性子ビームを利用した酵素反応中間体の結晶構造解析
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16KT0063
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| Research Institution | National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology |
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Principal Investigator |
安達 基泰 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 高崎量子応用研究所 東海量子ビーム応用研究センター, 上席研究員(定常) (60293958)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
森元 聡 九州大学, 薬学研究院, 教授 (60191045)
老川 典夫 関西大学, 化学生命工学部, 教授 (80233005)
木下 誉富 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (90405340)
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| Project Period (FY) |
2016-07-19 – 2020-03-31
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| Keywords | 酵素 / 結晶構造解析 / 中性子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
酵素(タンパク質)は、高度に進化した分子認識能とダイナミクスによって、複雑な骨格や多様な官能基を有する生理活性物質を効果的に合成する分子である。酵素の触媒機構の解明は、生命科学研究の発展と深く関わるだけでなく、複雑な化学構造をもった有用化合物を効率よく合成する産業技術の開発にも繋がる。本提案では、学術・産業の両面から有用な生合成経路を担うモデル酵素を研究対象として選択し、その反応中間体や遷移状態アナログ複合体の中性子結晶構造解析により、酵素の複雑で巧妙な反応触媒機構を解明する。また得られた知見を有用化合物の創製に資することを目的とする。
１、植物二次代謝化合物合成酵素の反応機構の解明に向けて、ポリケタイド合成酵素(PKS)の反応中間体の捕捉に注力して研究をすすめた。昨年構築した大腸菌発現系と精製方法により、PKSの調製を実施した。その結果、結晶を得ることができたが、X線結晶構造解析で、十分な分解能が得られていない。
２、アミノ酸ラセマーゼやアミラーゼ両酵素について、基質との複合体として、中間体を補足する実験を試みた。結果として、基質であるヒスチジンが補酵素であるピリドキサールリン酸と共有結合した中間体が得られ、1.0Å分解能のX線結晶構造解析に成功した。
３、創薬標的酵素においては、Ser/Thrキナーゼに注力した。阻害剤複合体の中性子解析に向けて複合体結晶作製のための条件検討を実施するとともに、阻害剤が結合する前の状態についても解析をすすめた。その結果、分子を縦断する水素結合のネットワークが、キナーゼの触媒反応に重要な役割をもつことを示す、新規で興味深い知見を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究での成果創出のためには、安定な試料調製系の確立と、高分解能な解析が可能な結晶の作製が土台となる。研究対象とするほぼすべての酵素に関して、それらが実現し、現時点では、中性子結晶構造解析のための大型結晶の作製や、分解能が高い質の良い結晶の作製に取り組んでいる。全4年間の計画の中で、必要な土台作りができていることから、十分な達成度で進捗していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
１、昨年度に引き続き、植物二次代謝化合物合成酵素の反応機構の解明に向けて、PKSの反応中間体の捕捉に注力する。PKSに関しては、触媒基の一つであるCys残基が容易に酸化され失活するので、溶存酸素を完全に除去した嫌気条件での精製・結晶化実験を実施し、リガンド複合体の結晶作製を行う。
２、アミノ酸ラセマーゼについては、得られている中間体の試料に関して、中性子結晶構造解析用のための、大型結晶の作製をすすめる。また、アミラーゼ酵素についても、中性子構造解析実現のための準備として、大型結晶作製条件を検討する。
３、創薬標的酵素においては、Ser/Thrキナーゼを引き続き対象とする。反応中間体の中性子解析の実現に向けてさらに条件検討を実すすめると同時に、分子を縦断する水素結合のネットワークの発見について、論文による報告をすすめる。
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| Causes of Carryover |
ヒスチジンラセマーゼに関する試料調製実験の一部を次年度に延期したため。
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