2017 Fiscal Year Research-status Report
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16KT0078
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| Research Institution | National Institute of Genetics |
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Principal Investigator |
澤 斉 国立遺伝学研究所, 構造遺伝学研究センター, 教授 (80222024)
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| Project Period (FY) |
2016-07-19 – 2020-03-31
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| Keywords | Wnt / 非対称分裂 / Frizzled / PCP / 細胞極性 / 細胞形態 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
線虫C. elegansのほぼ全ての細胞は同じ前後方向の極性を持ち非対称に分裂し、その結果、POP-1/TCFが前側の娘細胞に多くなる。この極性はWRM-1/βカテニンを介したWntβカテニン非対称経路で制御されている。この経路に加え、PCP（平面内極性）経路の因子、Vang-1/Van Gogh や カノニカル経路に働く因子、pry-1/Axinも関与しており、その変異体では特定の細胞の極性が逆転することを発見していた。表皮幹細胞はL2期に2回非対称分裂するが、1回目分裂の前側の娘細胞の、2回目の分裂の極性が逆転する結果、姉妹細胞の極性方向は鏡像対称になる。これらの細胞の形をajm-1::GFPで観察したところ、1回目の分裂後、姉妹細胞は鏡像対称な形（つまり反対向きの非対称な形）をしていた。この細胞形態の違いが極性に影響している可能性を検討するため、線虫の体が小さくなり、表皮幹細胞の形が丸くなる、dpy-17変異体で、vang-1とpry-1の効果を調べたところ、どちらの場合も姉妹細胞間の違いが消失した。細胞の非対称な形態が極性の方向に影響することが明らかになった。
pry-1/AxinはカノニカルWnt経路に置いてβカテニンの分解を制御している。pry-1変異体の非対称分裂異常にカノニカル経路が関与する可能性を調べるため、カノニカル経路に働き分解制御を受けるBAR-1/βカテニンの変異を導入した。すると、pry-1の極性逆転がbar-1の変異によって抑制された。またvang-1変異体の極性逆転も特定の細胞(V6.pa)ではbar-1によって抑制された。カノニカル経路と非対称経路がクロストークしていることが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
極性の方向付けに、Wntの受容体の発現勾配が重要な働きをしているという仮説を提唱している。LIN-17/Frizzledは細胞膜上に局在しているため、表皮幹細胞とその周りの細胞（融合表皮細胞）での発現を区別することは困難であった。そこで、融合表皮細胞のLIN-17::GFPをデグロン法などで分解させる実験を行ったが、分解の効率が低いため成功しなかった。そこで、 split GFP法を用いることにした。LIN-17のC末にGFPのC末断片(GFP11)を7個融合させて、lin-17自身のプロモーターで発現させ、N末断片（GFP1-10）を表皮幹細胞特異的に発現させた。その結果、GFPが表皮幹細胞でのみ再構成されて、細胞膜上にLIN-17の局在を観察することができた。しかし、融合遺伝子を多コピー導入したため発現量が多すぎたため、コピー数を減らして導入を試みている。
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| Strategy for Future Research Activity |
LIN-17は後方の細胞で強いという発現勾配を持っているが、別のWnt受容体であるCAM-1/Rorは前方で強い発現勾配を持っていた。CAM-1の表皮幹細胞での発現局在をLIN-17と同様にsplit GFPを用いて調べる。
表皮幹細胞の極性はLIN-17、CAM-1およびMOM-5/Frizzledによって制御されている。endogenousなmom-5遺伝子のC末端にCRISPR法でneonGreenを挿入した株を入手して表皮幹細胞での局在を調べると、細胞の後方に非対称に局在していることを発見した。この局在がWntによってどのように制御されているのか、Wnt変異体での局在、Wntの異所発現の効果を調べる。また、これらの遺伝子変異の組み合わせを以前作って表皮幹細胞の表現型を調べたが、cam-1とmom-5の二重変異体は胚性致死になり、幼虫での表現型は観察できなかった。そこでendogenousなmom-5遺伝子に分解シグナルdegronを挿入した株を作成し、auxin添加によって分解を誘導し、cam-1とmom-5が存在しない時、つまりLIN-17だけが機能する時の表現形を調べる。
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| Causes of Carryover |
連携研究者である研究員（遺伝研の直接雇用）が産休・育休を取ったため、彼女が使用する予定であった物品費が余った。
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