2016 Fiscal Year Research-status Report
新規レポーターシステムを用いて解き明かす炎症性疾患の発症と寛解のメカニズム
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16KT0114
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| Research Institution | National Center for Global Health and Medicine |
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Principal Investigator |
関谷 高史 国立研究開発法人国立国際医療研究センター, その他部局等, 室長 (80519207)
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| Project Period (FY) |
2016-07-19 – 2019-03-31
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| Keywords | 免疫寛容 / 生体イメージング / 自己免疫疾患 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
炎症性疾患の研究においては、発症前後の個体間や細胞間の比較解析は広く行われてきている一方で、発症過程を詳細にモニターした研究は少ない。その主な理由の一つとして、分化段階にあるThやTregをin vivoで検出できる強力なシステムが確立されていないことが挙げられる。そこで本研究は、分化段階のThやTregをin vivoで低侵襲的にモニターでき、かつ生細胞として単離・解析できる新規レポーターマウスを構築し、この現状にブレイクスルーを与えるものである。当該年度の研究では、このレポーターマウスの作製に用いるBAC(bacterial artificial chromosome)コンストラクトの作製を行った。このコンストラクトは、Nr4a2遺伝子座を含む約200kb程の遺伝子領域を含むBACクローンに対し、Nr4a2の1st ATG下流にin vivo検出用のルシフェラーゼ遺伝子、およびFACS解析用のGFP遺伝子、およびそれらを一過性発現に導くタンパク分解促進ドメインをタンデムに連結したレポーターユニットを挿入したものであり、Red/ETというシステムを用いた組み換え手法により作製を行った。引き続き、このBACレポーターコンストラクトを用いてトランスジェニックマウスを12系統作製し、現在最適な系統の選択を行っているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画書に記載した通り、初年度の計画はBACレポーターコンストラクトの作製、およびトランスジェニックマウスの作製であった。BACレポーターコンストラクトはPCRおよびシークエンスにより問題なく作製されていることを確認したうえ、トランスジェニックマウスも12系統と、理想的な数を作出することができたため、おおむね順調に進展していると評価できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、12系統作製されたレポーターマウスから、レポーターの発現強度、発現パターンに基づき、実験に最適な2～3系統に絞り込む。ルシフェラーゼ発光によるin vivo生体イメージングの条件検討を行った後、これらのレポーターマウスに炎症性疾患モデルをアプライし、以下の解析を行う。
1. 炎症性疾患発症過程、自然寛解過程におけるThとTreg活性化・分化の場の検出：本研究で対象とする炎症性疾患は、多発性硬化症のマウスモデルであるEAEと、炎症性腸疾患モデルとする。前年度の研究で構築したレポーターマウスに発症を誘導する。疾患誘導のスタートポイントは、EAEの場合は抗原/アジュバントによる免疫時、炎症性腸疾患モデルの場合は細胞移入時とする。その後、1日もしくは2日おきに、ルシフェラーゼ基質を注入した後、in vivo imaging systemでTh活性化の場を検出する。病態スコア、体重変化を記録しつつ、自然寛解期まで解析を続ける。Th活性化の場として、脾臓やリンパ節等の２次リンパ組織以外に、新規の場の存在が示唆された場合は、免疫組織染色により、その構造の詳細な解析を行う。
2. 分化段階ThとTregの細胞レベル・分子レベルでの解析：上述の低侵襲的解析により同定された、発症過程および自然寛解過程におけるTh,Treg活性化の場から、それぞれのステージで分化段階ThとTregを単離し、解析を行う。まず、それぞれの時期、それぞれの場で、どのThサブセットへの分化が主に見られるか、大まかな検討をFACSにより行う。次に、細胞をソーティングにより取得し、マイクロアレイもしくはRNA-seqによるトランスクリプトーム解析を行う。特徴的な発現パターンを示した遺伝子は診断マーカー候補として、さらなる検討を行う。
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| Causes of Carryover |
当該年度途中で異動（慶應義塾大学から国際医療研究センター）があり、引っ越し前後で研究のブランク、および研究費を使用できない期間があったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
異動後の研究環境も整ったため、予定通り研究を遂行する計画である。
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