病害土壌診断バイオマーカーの開発に向けたメタゲノム解析

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16KT0147
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 門田 有希 岡山大学, 環境生命科学研究科, 准教授 (30646089)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 横田 健治 東京農業大学, 応用生物科学部, 准教授 (80349810) ; 田淵 宏朗 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 九州沖縄農業研究センター, 上級研究員 (10355571)
• Project Period (FY): 2016-07-19 – 2019-03-31
• Keywords: 16Sメタゲノム解析 / 線虫 / 土壌

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、サツマイモの重要病害（立枯病）および線虫害が土壌に及ぼす影響を調査し、有効な病害土壌診断バイオマーカーを開発することである。これら病害・線虫害は作物の収量、外観品質に重大な被害をもたらす。しかし、サツマイモは遺伝的に複雑であり、抵抗性品種の育成は進んでいない。また、有害線虫および土壌病害の発生・抑制には土壌微生物相が大きく影響することが示唆されているが、科学的な知見は少ない。そこで本研究では、16Sメタゲノム解析を行い、ネコブセンチュウおよび立枯病発病・非発病土壌における微生物構成を網羅的に調査する。前年度の研究結果から、線虫の発病・非発病土壌間でその土壌微生物構成に大きな違いがあることが示された。属レベルでの比較では、土壌中に存在する46%の微生物種についてその存在比が異なるという結果が得られている。しかし、自然条件下のフィールドで得られたサンプルを使用したため、線虫発生の有無の他、様々な環境要因の影響を受けていた可能性がある。そこで今年度は、より厳密に制御した環境条件下において、線虫の発生が土壌微生物構成へ及ぼす影響を調査した。線虫の発生から時系列に複数回サンプリングを行うことで、土壌微生物構成や多様性の変化をリアルタイムで解析した。また、土壌サンプルからの核酸抽出に適した手法を検証するため複数の抽出キットを用い、その結果も比較した。
土壌試料のサンプリングは、九州沖縄農業研究センター（宮崎県都城市）の温室で行った。サツマイモ品種関東14号を用いてポット栽培を行い、線虫の接種・非接種区を設けた。接種前、接種60日後の土壌試料から核酸を抽出し、16S rRNA遺伝子のV3-V4領域を増幅することでMiSeqシーケンス用ライブラリを作製した。得られたシーケンスリードについてはQIIMEソフトウェアにより解析した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

今年度は、前年度までの研究結果を踏まえフィールドではなく、より厳密に環境条件を制御したガラス室内でサンプリングを行い、線虫の接種の有無と土壌微生物構成をよりダイレクトに比較することを目的とした。また、土壌からの核酸抽出キットは複数知られているが、その違いで検出される土壌微生物相に違いがみられるかも検証した。用いた核酸抽出キットはISOIL Beads Beating kit（ニッポンジーン社）とPowersoil DNA Isolation kit（MO-BIO）である。核酸抽出後16S rRNA遺伝子のV3-V4領域を対象とするPCR増幅によりMiSeqシーケンス用ライブラリを作成した。MiSeqによるシーケンスの結果、合計13,555,308ペアリードを得た（各サンプルにおけるリード数の範囲 : 96,324～906,978）。QIIMEを用い、ペアエンドリードの連結、クオリティチェック、キメラ配列の除去等の処理を行った結果、合計10,762,952リードを得た。各サンプルについて80,000リードを抽出し、微生物構成や多様性を調査した。その結果、線虫接種後の土壌サンプルの微生物多様性が他のサンプルと比較し最も低いことが示された。また、同じ土壌サンプルを試料としたにも関わらず、異なる核酸抽出キットを使用したサンプル間では、土壌微生物構成に大きな違いが確認された。よって、用いる核酸抽出キットの選択は菌叢解析結果に重要な影響にもたらすと考えられた。

Strategy for Future Research Activity

今年度の研究結果から、線虫接種から時間経過に伴い微生物多様性が変動すること、また核酸抽出キットの選択は菌叢解析結果に大きな影響をもたらすことが示された。特に核酸抽出キットの違いが解析結果に与える影響は予想以上に大きいと考えられたため、今年度は核酸抽出キットの違いが微生物種の特定に与える影響をより詳細に調査する予定である。

Causes of Carryover

シーケンス価格等低下しており、当初の予定よりもサンプル調整およびシーケンスに費用がかからなかったため、次年度使用額が生じた。解析用PCが必要となったため、その購入に使用する予定である。