2017 Fiscal Year Research-status Report
指向的相互作用による自律的皮質回路形成メカニズムの解析
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16KT0171
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
藤島 和人 京都大学, 高等研究院, 特定助教 (20525852)
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| Project Period (FY) |
2016-07-19 – 2019-03-31
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| Keywords | 樹状突起形成 / 神経回路形成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、樹状突起が軸索束に対して直交した方向に進展するメカニズムの解明を目的とする。このような伸長特性は生体内でのプルキンエ細胞樹状突起の平面性獲得に関わる。特に、膜骨格分子であるSpectrin beta IIIに着目する。当該分子の欠損細胞では、樹状突起生育方向に異常が生じ、直交方向への進展が阻害される。進展する樹状突起側部には多くのフィロポディアと呼ばれる微突起が形成される。通常、微突起はおおむね軸索束と同方向に形成される。前年度までにin vitro 培養系でshRNAを用いてSpectrin beta IIIを欠失した細胞の樹状突起ではフィロポディアのダイナミクスが亢進していることを見出していた。フィロポディアが異常に進展することで、方向性の誤った樹状突起が形成される可能性が示唆された。本年度は、以下の二点について研究を進めた。
(1)フィロポディアの形成異常が生体内でも行われていることを確認した。In utero electroporationにより、shRNA ベクターを小脳プルキンエ細胞に導入し、生後14日齢で固定し、その後コンフォーカル顕微鏡を用いてフィロポディアの形態を観察した。その結果、対照群に比べ、Spectrin beta IIIを欠失した細胞では通常形成される樹状突起の面から突出する方向に、異常に進展したフィロポディア様構造が観察された。
(2)前年度までに、フィロポディアの異常進展は微小管がフィロポディアに侵入することに起因する可能性が示唆されていた。本年度も引き続き微小管のプラス端に結合するEB3の樹状突起における動態を観察した。Spectrin beta III欠失細胞で樹状突起フィロポディアに侵入するEB3数が上昇する傾向にあった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では小脳回路形成に着目し、軸索に対して樹状突起が直交方向に形成されるメカニズムの探索を行ってきた。直交性を制御する候補因子としては主にSpectrin beta IIIに注目している。これまでに軸索-樹状突起の直交パターンを再現するナノ繊維培養系を用いて、樹状突起の成長パターンを経時観察していた。この二次元的な再現系を用いて、直交性形成過程における、樹状突起の基本ダイナミクスが明らかになりつつある。当初myosin IIBとSpectrin beta IIIが協調して働いていることを想定していたが、現在のところ明確な相互作用は見られなかったため、まずはSpectrin beta IIIに集中することが得策であると考えている。Spectrin beta III分子の発現阻害を行ったときに観察される、フィロポディアの形成異常に注目している。通常よりフィロポディアの進展が亢進すること、それが異方向への樹状突起伸長をもたらす可能性を追跡している。本年度は、フィロポディアの異常進展が生体内においても観察されることを確認した。異常に進展したフィロポディアが樹状突起に移行する過程は捉えられておらず今後の課題となる。当初予定していたSpectrin 関連分子であるadducin やankyrin については機能阻害を行っても現在のところ直交性への明確な影響を確認することはできなかった。したがって前年度から着目し始めた微小管のダイナミクスの解析に本格的に着手し始めた。微小管の伸長端をラベルするEB3-EGFPを用いてダイナミクスを観察したところ、欠損樹状突起ではＥＢ３のフィロポディアへの侵入が亢進していることを見出している。Spectrin beta IIIが微小管のフィロポディアへの侵入をブロックしている可能性が考えられ、詳細なメカニズムの解析や探索を計画している。
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| Strategy for Future Research Activity |
Spectrin beta III の欠失時に、樹状突起は進行方向を誤る。これは樹状突起フィロポディアが異常進展することで、通常とは異なる方向に樹状突起を形成することに由来する可能性が示唆されている。しかし、実際にフィロポディアが伸びて樹状突起に転換されていく様子を捉えらることのできた例数はまだ少ない。コントロールおよびSpectrin beta III欠失細胞の樹状突起の形成過程を高解像度かつ長時間にわたり経時観察を行い、フィロポディアから樹状突起形成に至るまでの動態を解析する。
また、Spectrin beta III の欠失は、微小管のフィロポディアへの侵入をもたらし、異常進展をもたらすことを見出している。いかにしてSpectrin beta III が微小管のダイナミクスを制御するかを明らかにする。これまでの観察によりSpectrin beta IIIは樹状突起シャフトの細胞膜直下およびフィロポディアの起始部に強く局在することを確認している。Spectrin beta III分子がフィロポディア起始部で微小管の侵入を妨げている可能性が考えられる。一般に微小管がF-アクチンが密に存在するフィロポディア内に侵入する際には、微小管のプラス端に局在し、さらにFアクチンとも結合しうるナビゲータータンパク質の存在が必要とされる。Spectirn beta IIIの欠失により、樹状突起フィロポディアにおける局在に変化があるナビゲータータンパク質を探索する。さらに、そのナビゲータータンパク質がSpectrin beta III阻害時おこる樹状突起フィロポディアへの微小管の侵入と関係するか確認する。
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| Causes of Carryover |
研究の過程で、Spectrin betaIIIが、微小管ダイナミクスを制限することでフィロポディアダイナミクスおよび樹状突起形成を調整する仕組みが明らかになりつつある。本年度は、当初予定していたmyosin IIbの影響を解析せず、Spectrin beta IIIの機能解析に主眼を置いた研究を執り行った。また次年度よりSpectrin beta III による微小管の動態調整メカニズムを解析・探索する予定である。そのため本年度使用を予定していた所要額の一部を次年度に繰り越した。
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