Cas9人工転写オシレーターを用いたリズム発振原理の解明とその応用

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16KT0175
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 土谷 佳樹 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (30456777)
• Project Period (FY): 2016-07-19 – 2019-03-31
• Keywords: 人工遺伝子回路

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、哺乳類細胞内にCRISPR/Cas9システムを応用した人工的な転写フィードバックループを作製し、人工転写オシレーター（振動体）を創出することによって、遺伝子発現リズムの発振原理を解明することを目的とする。初年度は転写抑制因子のプロモーターに用いるsgRNAターゲット配列の選定を行った。また、作成済の転写アクチベーターと転写リプレッサーの転写調節能を検討した。sgRNA配列はホモロジー検索ツールであるbowtieやウェブで公開されているCRISPRターゲット配列の検索ツール（CRISPR direct (http://crispr.dbcls.jp/), CRISPR DESIGN (http://crispr.mit.edu:8079/))を用いてゲノム上に類似配列のないものを複数選定した。また、内在性遺伝子のプロモーターを標的とするsgRNAと人工転写因子を培養細胞に導入して、内在性遺伝子の発現を指標に転写調節能を検証した。その結果、転写リプレッサーによる転写抑制は見られたが、転写アクチベーターによる発現上昇は低いレベルにとどまっていた。この結果から、転写アクチベーターについてはさらなる検討が必要であると考えられた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

人口転写オシレーターに使用するsgRNA配列の設計と転写因子活性の検証を行い、転写アクチベーターについてはさらなる最適化が必要であると考えられた。入手可能な種々のアクチベーターを含めたさらなる条件検討を行う作業によりやや進捗に遅れが出ているが、本研究は培養細胞を用いた実験系であるため、今後のキャッチアップは十分可能であると考えている。

Strategy for Future Research Activity

設計したsgRNA配列による転写制御が可能かどうか、細胞に導入して検証する。また、転写アクチベーターについては、使用する転写活性化ドメインなどに様々なタイプのものが開発されており、Addgene等で入手可能となっている。これらの転写アクチベーターについても入手して転写活性化能を検証する。少なくとも2倍以上の転写活性化を誘導できるシステムを用いて転写ネットワークの導入を行う。

Causes of Carryover

人工転写因子の条件検討に時間を要し、細胞への導入実験等を次年度以降に行うこととなったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

人口転写因子発現ベクターの作製と細胞への導入実験、転写活性測定実験に充当する。