Cas9人工転写オシレーターを用いたリズム発振原理の解明とその応用

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16KT0175
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 土谷 佳樹 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (30456777)
• Project Period (FY): 2016-07-19 – 2019-03-31
• Keywords: 人工遺伝子回路 / 概日リズム

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、哺乳類細胞内にCRISPR/Cas9システムを応用した人工的な転写フィードバックループを作製し、人工転写オシレーター（振動体）を創出することによって、遺伝子発現リズムの発振原理を解明することを目的とする。今年度は前年度に引き続き、転写アクチベーターと転写リプレッサーの転写調節能を検討した。また、概日時計の転写フィードバックループについて、主要時計遺伝子の欠損細胞を作製し、欠損遺伝子を異所性に発現させるadd back実験から、シスエレメントの重要性についての新しい知見を得ることができた。概日転写フィードバックループではE-boxやD-box、RREなどの転写制御シス配列に転写因子が結合するが、それらのリズム形成における重要性については不明な点も多く、本解析から遺伝子発現リズムの発振原理解明に繋がる知見が得られることが期待される。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

現在までに人工転写オシレーターに使用するsgRNA配列の設計と転写因子活性の検証を行っている。また、概日時計の転写フィードバックループモデルに関するデータから、遺伝子発現リズムの発振原理の理解に繋がる知見を得た。人工転写因子のさらなる条件検討を行う作業によりやや進捗に遅れが出ているが、今後のキャッチアップは十分可能であると考えている。

Strategy for Future Research Activity

設計したsgRNA配列による転写制御が可能かどうか、ヒトU2OS細胞に導入して検証する。転写アクチベーター、転写リプレッサーとともに発光レポーターを細胞に導入し、転写制御能を検証する。少なくとも1細胞レベルで発光が検出可能となる発現制御を行えるよう、導入レポーターのプロモーターや転写アクチベーターの誘導レベルなどの条件検討を行う。

Causes of Carryover

（理由）
人工転写因子の条件検討に時間を要し、大規模な細胞への導入実験は次年度に行うこととなったため。
（使用計画）
人口転写因子発現ベクターの作製と細胞への導入実験についての条件検討および転写活性測定実験に充当する。