2016 Fiscal Year Research-status Report
器官サイズの再生現象における痛みシステムバランスの理解
| Project/Area Number |
16KT0176
|
|---|
| Research Institution | Jikei University School of Medicine |
|---|
Principal Investigator |
矢野 十織 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (10648091)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川村 将仁 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (10408388)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-07-19 – 2020-03-31
|
| Keywords | ゼブラフィッシュ / 再生 / 鰭 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本課題は、脊椎動物の器官・組織の創傷0秒後から生じる分子・細胞レベルでの創傷刺激受容をイメージング技術によって数値化し、器官・組織の修復度合（再生サイズ）との関連性を明らかにする。研究実施に際しては平成30年度以降に創傷刺激受容を実測することを目指し、平成28-29年度を「創傷刺激受容に関わる素過程の数値化法の確立」といった準備期間に位置づける。本年度（初年度）は研究実施計画に沿って実験を遂行した。また、着目した分子シグナル経路を阻害する実験系のなかで、器官再生時に特定組織の形成不全が生じたため、これに関して研究協力者と詳細な解析を行った。
具体的には、ゼブラフィッシュの鰭（ヒレ）を器官再生のモデルとし、鰭の再生に関わる素過程を数値化する。まずは鰭切断面積や再生サイズを計測するために、ユビキタスプロモーターの下流で蛍光タンパク質を発現する遺伝子組換え個体を作製した。また細胞障害レベルを定量化する方法として、活性酸素の活性を可視化する遺伝子組換え個体と、好中球・マクロファージを可視化する遺伝子組換え個体を作製し、F1個体の飼養にまで至った。好中球・マクロファージは器官再生サイズの調節に重要であることが既に報告されているが、得られたデータからはこれら細胞の分布において新たな知見が得られた。次に、鰭創傷部位周辺の細胞における膜電位変化を捉えるべく、研究分担者とともにin vivoパッチクランプ実験系の構築を目指した。従来の実験系では、標的細胞に電極を当てる際に胚を創傷する必要があるため、本研究のように創傷時の細胞膜電位を測定する際には、胚の固定法・電極の挿入部位を工夫する必要があった。また胚発生の時間によって表皮組織の柔軟性が異なり、最も実験がし易い胚発生期では対象とする鰭組織領域が微小であるといったジレンマが生じたが、最適な測定法を確立するうえでの改善点を抽出できた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
遺伝子組換え個体の作製は実施計画通りに進行した。またCRISPR/Cas9法を用いた再生関連遺伝子のノックアウト実験も実施計画通りに遂行し、鰭再生サイズの変化を伴った異常な再生が観察された。これら研究材料を解析する際には大学共用設備の共焦点レーザー顕微鏡を用いるが、本年度は実施計画に沿ってデータ解析用のコンピューターを購入したため、本課題の研究協力者が占有できる研究環境を整備できた。in vivoパッチクランプ実験に関しては、実施計画の立案から実際のオペレーションにかけて研究分担者の貢献が大きく、本年度は実験系確立に向けて多くの時間を費やした。これは学内異分野領域の研究者を研究分担者としたため、実験毎の改善点を次回に反映させることが所属機関内でスムーズにできた。本課題においては、再生現象の素過程それぞれについて上記のように実験系を構築し、トランスクリプトームデータと合算することによって、複雑な器官再生をシステムレベルで捉える事が可能となる。したがって単一の実験系に偏重すること無く、全実験系がバランス良く進捗した点を鑑みれば、本年度は順調な研究進展があったと考えられる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
研究計画にあった遺伝子組換え個体の作製実験のほとんどが完了したため、次年度はこれの定量解析法の確立を行っていく。
CRISPR/Cas9法による遺伝子ノックアウト実験は胚性致死となり、想定通り成魚での解析は困難であると考えられる。したがって研究計画段階でも検討した通りに胚を用いてトランスクリプトーム解析を行う予定である。この場合、RNAインジェクション個体（F0個体）を用いた解析となるため、ゲノム編集効率についても勘案する必要があると考えられる。
in vivoパッチクランプ実験は、本年度に抽出した問題点を解決しながら引き続き研究分担者とともに実験系の構築を目指す。
研究協力者が本年度に得たデータの一部は学会発表により報告した。本年度に研究代表者が作製した遺伝子組換え個体を用いてさらに解析を行うことによって、論文作成に十分な成果が次年度中に揃うのではないかと考えており、次年度は特に連携研究者・共同研究者を含めたチーム全体で研究の方向性を定めていく。また本年度は必要に応じて学内にある基盤研究施設への受託解析も行ったが、次年度以降も役割分担を明確にして、堅実にデータを蓄積できるよう研究統括していく。
|
| Causes of Carryover |
研究計画調書に記載の通り、トランスクリプトーム解析は次年度（平成29年度）行う項目であるが、研究進捗を考慮すると本年度末に解析発注の可能性があったため、解析費用を初年度の物品費として計上した。このように研究計画時から研究費使用に関する本年度・次年度の区別がしにくい理由は、本課題採択・内定が7月と遅いためである。実際に本年度末までに発注しなかったため、次年度使用額が生じた。
また設備備品費としてゼブラフィッシュ飼育装置の購入費を計上した。しかし所属機関の研究棟の老朽化に伴う研究室移動の可能性が本年度開始時に浮上したため、設備備品として恒久的な使用が可能か検討する必要があった。さらに本年度は既存の飼育装置において老朽化に伴う漏水が4箇所みられた。ゆえに新規設備購入よりも既存設備の維持のほうが、研究計画調書の研究費の必要性で主張した「飼育スペースの不足」を補填できると判断し本年度の購入を断念した。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
CRISPR/Cas9法による遺伝子ノックアウト実験は順調に進展したため、次年度使用額は確かに生じたものの、当初の研究計画調書通りにトランスクリプトーム解析費用として次年度執行する。
またゼブラフィッシュ飼育装置の新規購入の代わりに、次年度は既存飼育装置の修繕ならびに飼育水槽の追加を検討している。これによって、設備備品購入に係る時間的拘束（既存飼育装置の移設工事とこれに伴う魚類使用実験の停止）を無くし、本年度の研究進捗度合を次年度も維持できると考えている。
|
Research Products
(3 results)
