2017 Fiscal Year Research-status Report
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16KT0179
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
松岡 里実 国立研究開発法人理化学研究所, 生命システム研究センター, 研究員 (00569733)
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| Project Period (FY) |
2016-07-19 – 2019-03-31
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| Keywords | 自発性 / 細胞運動 / 細胞極性 / イノシトールリン脂質 / PI(3,4,5)P3 / PI3K / PTEN |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞は細胞外からの刺激入力がなくても自発的に運動する。細胞内では前後極性のシグナルが自発的に生成しており、このメカニズムを理解することは生物が利用する自己組織化の原理の理解につながる。本研究課題では、前側シグナルであるイノシトールリン脂質PI(3,4,5)P3の代謝系において、自発的なシグナル生成に最低限必要な分子反応ネットワークの構成分子種を明らかにすることを目的として、ダイナミクスをリポソーム内で再現する再構成実験を行う。本年度は、リポソーム内でPI(3,4,5)P3のリン酸化・脱リン酸化反応を任意のATP濃度において行うために、主に次の３点について再構成実験系の改良を行った。まず、リポソームの調整条件を最適化した。これにより比較的均一なリポソームを再現性良く調整することが可能になった。次に、ビオチン・アビジンを用いてカバーガラス表面へのリポソームの固定化を行った。これによりリポソーム外液の対流の影響をうけずに同一リポソームの蛍光強度の時間変化を顕微鏡下で計測することが可能になった。最後に、ヘモリシンを用いてリポソーム膜に孔を形成し、リポソーム外液の交換によってリポソーム内の低分子の濃度を操作することを可能にした。これにより、リポソーム内のPI3Kによるリン酸化反応を任意のタイミングでATPを添加して開始させることが可能となった。以上より、PI3KとPTENを同時に内包するリポソームの膜におけるPI(3,4,5)P3の時空間ダイナミクスを幅広い化学反応条件下でイメージング解析する実験系を構築できた。今後、これらの基盤技術を元に、生細胞の細胞膜で見られるPI(3,4,5)P3のダイナミクスが再現される条件を探索する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画していた通りに、細胞内で見られるダイナミクスの再現に必要な最小構成要素を網羅的な化学反応条件下で探索するために不可欠な基盤技術を構築することに成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
PI(3,4,5)P3代謝系における自発的なシグナル生成に最低限必要な分子反応ネットワークの構成分子種がPI3K、PTEN、PI(4,5)P2およびPI(3,4,5)P3の４種である可能性について、網羅的な化学反応条件下で再構成実験を行って検証する。このため、今年度までに構築した実験系を用いて、多様な濃度の組み合わせでこの４成分を内包するリポソームを作成して幅広いATP濃度において反応を開始し、リポソーム膜上のPI(3,4,5)P3レベルの時空間変化を蛍光タンパク質性レポータを介して共焦点顕微鏡を用いて計測する。これにより実際の細胞で観察されるPI(3,4,5)P3の進行波あるいは一過性ドメイン生成のダイナミクスを再構築することを目指す。これらのダイナミクスを再現できなかった場合には、最低限必要な分子反応ネットワークの構成分子種はこの４種以外にも存在すると考えられる。そこで、PI3Kの活性化に働くことが知られているGTP結合型RasおよびRasの活性化・不活性化因子を再構成実験系に追加して、PI(3,4,5)P3のダイナミクスの再構成を目指す。
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| Causes of Carryover |
今年度は上述の４成分による再構成実験系を構築した。このために徹底的な条件検討を行ったため、当初計画していた外部からリポソームにタンパク質を追加する実験系の立ち上げには至らなかった。次年度において、外部からリポソームにタンパク質を追加する実験および計画外に導入する実験に使用する。また、これまでに得られた成果を発表するために使用する。
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