非開始コドンから翻訳されたタンパク質バリアント中のストレスバイオマーカーの探索

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16KT0191
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 小川 哲弘 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 助教 (40323480)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 角田 茂 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 准教授 (80345032) ; 小川 智子 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 本部, 主任研究員 (90466011) ; 藤井 渉 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 助教 (40708161)
• Project Period (FY): 2016-07-19 – 2019-03-31
• Keywords: ストレス / バイオマーカー / 非AUGコドン

Outline of Annual Research Achievements

昨年度より、非AUGコドンからの翻訳開始に関わる因子として、機能の詳細が不明であったストレス応答性翻訳開始因子eIF2Aに注目し、この因子の遺伝子を破壊したマウス胚線維芽細胞（MEF）の樹立を新たに開始した。本年度は、これを継続して行った。マウスC58BL/6の受精卵に対し、eIF2A遺伝子のエキソン2およびエキソン4を標的とし、CRISPR/Cas9法により遺伝子破壊を試みた。このうち、エキソン2を標的とした場合、13.5dpcで全ての胚が退行しており、MEFの樹立が出来なかった。一方でエキソン4を標的とした際には、同13.5dpcで1腹から10匹の胎児が取得できた。このうち、配列解析および抗eIF2A抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、適切に遺伝子破壊が出来たMEFを絞り込んだ。このeIF2AノックアウトMEFおよび野生型MEFに対して熱ストレスを作用させた後、リボソームプロファイリングに供する低分子RNAの調製を行った。
また、Fibroblast Growth factor-2（FGF-2）において、ストレスに応答して非AUGコドンからの翻訳開始が促進されること、またHeLaなどの株化細胞では、こうした非AUGコドンからの翻訳開始が恒常的に活性化されていることが報告されていた。そこで、これにeIF2Aが関わると予想し、実験的に検証を行った。内在性FGF-2は、ウエスタンブロッティングによる検出が困難であった。そこで、エピゾーマルベクターよりFGF-2をHeLa細胞で強制発現させた。この株に対し、eIF2Aをノックダウンした際に、FGF-2の非AUGからの翻訳開始が抑制されるか検証中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初の実験計画では、昨年度中にリボソームプロファイリングを実施し、非AUGコドンからの翻訳産物を網羅的に解析する予定であった。しかし、リボソームプロファイリングに供する改変細胞の樹立が予想以上に長引き、本年度でようやく作製に成功した。また、本年度末までに、サンプルの調製まで終了させた。こうしたことから、当初本年度に計画していた「非AUGコドンからの翻訳産物の抗ストレス活性評価」まで到達することが出来なかったため「やや遅れている」と判断した。

Strategy for Future Research Activity

今後は、すみやかにRNAseq解析を発注し、得られたデータの解析を通してバイオマーカー候補の絞り込みを行うこととする。この際、既存の非AUGコドンからの翻訳産物データベースも活用し、効率化に努める。

Causes of Carryover

（理由）
リボソームプロファイリングに供するサンプル調製を終えたが、本年度中にRNAseqの発注まで行えなかった。そのため、「その他」に計上していたRNAseqの受託解析費を使用しなかった。また、「その他」に、RNAseqで得られた配列のデータ解析に使用するソフトウエアの年間使用契約費を計上していた。しかし、RNAseqを実施しなかったため、データ解析を行わなかった。そのため、 本ソフトウエアの本年度契約を見送った。
（使用計画）
リボソームプロファイリングのためのRNAseq受託解析費として使用する。