テロメアの1本鎖DNA領域に結合するPot1蛋白質のテロメア調節の立体構造的基盤

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17012022
• Research Institution: Tokyo University of Science
• Principal Investigator: 鳥越 秀峰 東京理科大学, 理学部, 助教授 (80227678)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 緒方 一博 横浜市立大学, 医学部, 教授 (90260330)
• Keywords: テロメア結合蛋白質 / テロメア1本鎖DNA / 3次元構造 / ゲルシフト法 / 点変異

Research Abstract

Pot1のN末端側182アミノ酸残基がテロメア1本鎖DNA領域との特異的な結合に必要なドメイン(DBD)であることを既に明らかにしている。大腸菌内での大量発現系を用いたPot1DBDの調製方法についても既に確立しており、この系を用いてPot1DBDを調製した。本研究では、Pot1DBDとd(GGTTAC)の複合体の3次元構造を詳細に解析した。複合体中のPot1DBDの3次元構造は3本のαヘリックスと8本のβストランドを有するOB(oligonucleotide/oligosaccharide binding) foldのファミリーに属することが明らかとなった。複合体中のd(GGTTAC)は、ランダムな構造ではなく屈曲した独特の構造を有していることが明らかとなった。また、Pot1DBD側のK124,D125がd(GGTTAC)側のG1と、Pot1DBD側のT111,S123がd(GGTTAC)側のG2と、Pot1DBD側のT62,K90がd(GGTTAC)側のT3と、Pot1DBD側のS58,D64がd(GGTTAC)側のT4と、Pot1DBD側のR56,L59がd(GGTTAC)側のA5と、Pot1DBD側のY115,Q120がd(GGTTAC)側のC6と水素結合で特異的に結合していることを明らかとなった。
次に、d(GGTTAC)とは長さや塩基配列の異なる一連の変異型テロメア1本鎖DNAのオリゴヌクレオチドをDNA合成機で合成し、逆相HPLCで精製した。これらと野生型Pot1DBDとの結合能をゲルシフト法で解析した。6塩基いずれについても他の塩基に置換したり、6塩基より短くしたりすると、Pot1DBDとの結合能が低下した。これより、d(GGTTAC)がPot1DBDとの特異的な結合に必要である、テロメア1本鎖DNA側の最適な塩基配列であることを明らかにした。
さらに、複合体の3次元構造からd(GGTTAC)との複合体形成への関与が考えられるPot1DBD側のアミノ酸残基に点変異を導入するため、点変異導入用発現プラスミドを構築し、大腸菌内での大量発現系を用いて変異型PotlDBDを調製した。これらとd(GGTTAC)との結合能をゲルシフト法で解析した。S58A,K90AおよびD125Aは野生型と比較してd(GGTTAC)との結合能がほとんど変化しなかったが、D64A,Q120LおよびK124Aは野生型と比較してd(GGTTAC)との結合能が有意に低下した。複合体の3次元構造からd(GGTTAC)との複合体形成への関与が示唆されているアミノ酸残基の中でも、複合体形成への関与の度合が大きいアミノ酸残基と小さいアミノ酸残基があることが推察された。また、複数のアミノ酸残基が1つの塩基を認識している場合には、片方のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されても他方のアミノ酸残基がd(GGTTAC)との結合能を保持し得るように補償する場合があることが推察された。

Research Products

• [Journal Article] Combination of Poly (L-lysine)-graft-dextran Copolymer and 2'-O,4'-C-methylene Bridged Nucleic Acid (2',4'-BNA) Modification Synergistically Stabilizes Pyrimidine Motif Triplex at Neutral pH (2005)
  • Author(s): Torigoe, H., Katayama, T., Obika, S., Maruyama, A., Imanishi, T.
  • Journal Title: Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 24 Pages: 635-638
• [Journal Article] Novel Strategy for Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Genotyping by Heteroduplex Analysis : specific Stabilization of TT Mismatch Base Pair by Mercury (II) Cation and CC Mismatch Base Pair by Silver (I) Cation (2005)
  • Author(s): Torigoe, H., Kawahashi, K., Takamori, A., Ono, A.
  • Journal Title: Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 24 Pages: 915-917
• [Journal Article] Promotion of Pyrimidine Motif Triplex Formation by Morpholino Modification of Triplex-forming Oligonucleotide : Kinetic and Thermodynamic Studies (2005)
  • Author(s): Torigoe, H., Kawahashi, K., Tamura, Y.
  • Journal Title: Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 24 Pages: 1019-1021
• [Journal Article] Tetraplex Structure of Fission Yeast Telomeric DNA and Its Unfolding by the Interaction with Telomeric DNA Binding Protein Potl (2005)
  • Author(s): Furukawa, A., Torigoe, H.
  • Journal Title: Nucleic Acids Symp.Ser. 49 Pages: 63-64
• [Journal Article] Thermodynamic Analyses of the Specific Interaction between C : C Mismatch Base Pair and Silver (I) Cation : Toward the Efficient Detection of Single Nucleotide Polymorphism (2005)
  • Author(s): Torigoe, H, Kozasa, T., Takamori, A., Ono, A.
  • Journal Title: Nucleic Acids Symp.Ser. 49 Pages: 217-218
• [Journal Article] Development of Triplex Formation-based Artificial Transcription Factor to Recognize Any Upstream Sequence of Target Genes (2005)
  • Author(s): Torigoe, H., Tsukamoto, Y.
  • Journal Title: Nucleic Acids Symp.Ser. 49 Pages: 321-322
• [Book] "Novel Strategy for Efficient Detection of Single Nucleotide Polymorphism (SNP) : specific Binding of Mercury (II) Cation to T : T Mismatch Base Pair and That of Silver (I) Cation to C : C Mismatch Base Pair" in "Moleculomics and Thereafter" (2006)
  • Author(s): Torigoe, H., Ono, A.
  • Total Pages: 21
  • Publisher: Research Signpost, Ltd.