2005 Fiscal Year Annual Research Report
がん治療のためのアデノウイルスベクターおよび発現制御システムの開発
| Project/Area Number |
17016014
|
|---|
| Research Institution | The University of Tokyo |
|---|
Principal Investigator |
斎藤 泉 東京大学, 医科学研究所, 教授 (70158913)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鐘ヶ江 裕美 東京大学, 医科学研究所, 助手 (80251453)
|
|---|
| Keywords | アデノウイスルベクター / guttedベクター / 部位特異的組換え酵素 / Cre / loxP / FLP / FRT |
|---|
| Research Abstract |
がんの遺伝子治療の実用化に向けて本研究ではがん細胞特異的高度発現機能を有する改良型アデノウイルスベクターとして、がん細胞特異的プロモーターからCreを発現する「制御ユニット」と強力なプロモーターからの目的遺伝子の発現をCreによりOFFからONへと制御する「発現標的ユニット」を一つのウイルスベクターに組み込む「単一型特異的高度発現ベクター」作製法の開発を行っている。本年度は当ベクターとして用いるヘルパーウイルス依存型ベクター作製法の効率化を目的とした組換え効率の高いFLPの同定を行った。FLPにおいてはこれまで細胞への毒性の報告は無かったが、本研究の解析により、発現効率を上昇した新規hFLPeでは細胞における何らかの影響の結果タンパク質あたりの組換え効率が低下する傾向が明らかになった。一方FLP及びhFLPe発現293細胞での組換え効率はほぼ同程度であり、しかも標的配列間の切り出し効率はCreよりも優れていた。そこでこれらの発現細胞を用いて、完全長ウイルスベクター作製法によりヘルパーウイルス依存型ベクターの作製を試みた結果、hFLPe発現細胞の方が高い作製効率を示したため、今後はhFLPe発現細胞を用いて単一型ベクターの作製を試みる方針を決定した。また単一型ベクターでは制御ユニット上のCreがベクター作製時にリーク発現することにより目的遺伝子の発現がONのベクターが混入し、特異性が低下する可能性が指摘されてきた。本年度は肝細胞がん特異的(AFP)プロモーターの293細胞での特異性を検討した。その結果、AFPプロモーターはアデノウイルスの複製によるコピー数の上昇時においても高い特異性は保っていたがCreの活性は認められた。そこでCreのdominant negativeを3種類作製し効果を比較したところ、これまでに報告されていた活性中心の変異体よりも高い抑制効果を示すdominant negativeの同定に成功した。
|
