2005 Fiscal Year Annual Research Report
老化に特異な新規構造体Rubisco-containing bodyの特性解析
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17051002
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
前 忠彦 東北大学, 大学院・農学研究科, 教授 (60134029)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
牧野 周 東北大学, 大学院・農学研究科, 助教授 (70181617)
鈴木 雄二 東北大学, 大学院・農学研究科, 助手 (80374974)
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| Keywords | シロイヌナズナ / Rubisco / Rubisco-containing body / 老化 / オートファジー |
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| Research Abstract |
Plastid-targeted GFPを発現するシロイヌナズナ緑葉を用いて、RCBの生細胞における可視化法について検討した。GFPは新鮮葉においてはストロミュールを含めた葉緑体のみに特異的に局在していた。葉を個体から切離後、コンカナマイシンAあるいはE-64dを浸透させインキュベートすると、処理後10時間あたりからGFP蛍光をもつ小胞が液胞内に蓄積することがわかった。この小胞は直径が0.5-1.5μmでクロロフィルの自家蛍光を持っていないなど、電顕におけるRCB像とよく似た特徴を有していた。またシロイヌナズナ野生株をこれらの阻害剤で同様に処理すると、免疫電顕において液胞コンパートメントにRCBが見られることから、このGFP蛍光を持つ小胞が形質転換体作成に伴うartifactではないことが考えられた。GFP小胞の蓄積には葉のageによる違いがあり、若い展開中の葉では全く見られず、成熟葉やvisible senescenceの始まった葉で見られた。またGFP小胞は葉を栄養培地(MS)でインキュベートすると阻害剤存在下でも蓄積しなかった。
今回確立した生細胞における可視化法を用いて、葉緑体の分裂異常が起こるarc mutantやオートファジー変異体atg4a4b-1でRCBの蓄積が見られるかどうかについて検討した。RCBは、arc mutantの中でも特にシビアな表現型を示し、葉肉細胞に2-3個の巨大な葉緑体が存在するarc 6やarc 5においても見られた。一方、atg4a4b-1では35Sプロモーター制御下のplastid-targeted GFPの発現が、野生株に比べ1/10程度まで抑制されるという問題が生じたものの、RCBの蓄積は液胞だけでなく細胞質においても見られなかった。この結果はRCBの蓄積がATG4遺伝子に依存したものであることを示唆している。現在、別系統のplastid-targeted GFP形質転換体とatg4a4b-1との交配、plastid-targeted DsRedとautophagosomeのマーカーであるGFP-ATG8aを用いた蛍光2重染色、ならびに免疫電顕によりRCBの形成とオートファジー機構との関連性についてさらに解析を進めている。
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