2007 Fiscal Year Annual Research Report
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17076009
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
今中 忠行 Kyoto University, 工学研究科, 教授 (30029219)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
金井 保 京都大学, 工学研究科, 助教 (10346083)
吉川 祐子 環太平洋大学, 次世代教育学部, 教授 (80291871)
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| Keywords | 超好熱菌 / 無細胞翻訳系 / 人工モデル細胞 / 膜タンパク / 転写系 |
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| Research Abstract |
これまでに超好熱始原菌Thermococcus kodakaraensisを用いた無細胞翻訳系の開発を行ってきた。本年度は、本系において外来種由来タンパクを含む幅広い種類のタンパク生産が可能であるかを検討するために、そのモデルケースとしてGreen fluorescent protein (GFP)の合成を試み、主に以下の3点の工夫により、活性型GFPを合成することに成功した。1)遺伝子コドンの最適化、2)mRNAの3'末端へのステムループ構造の導入、3)反応系へのシャペロニン(HSP60)の導入。まず遺伝子コドンをT. kodakaraensisにおける使用頻度に合わせて作り直した結果、それ以前は検出限界レベルであった合成量が、100程度上昇した。続いて、細胞抽出液内のヌクレアーゼによる分解を避けてmRNAが安定に存在できるように、その3'末端にステムループ構造を導入したところ、さらに約3倍のタンパク生産量の上昇が見られた。しかしながら生産されたGFP中で活性(蛍光)をもつタンパクの割合は約30%程度に留まっていたため、続いてタンパクの折りたたみを促進するシャペロニンを系に加えた。その結果、正常に折りたたまれたGFPの割合は約50%にまで上昇した。
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