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2009 Fiscal Year Annual Research Report

全ゲノムのin vitro転写・翻訳系の開発

Research Project

Project/Area Number 17076009
Research InstitutionRitsumeikan University

Principal Investigator

今中 忠行  Ritsumeikan University, 生命科学部, 教授 (30029219)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 金井 保  京都大学, 工学研究科, 助教 (10346083)
Keywords超好熱菌 / in vitro転写 / in vitro翻訳 / リボソーム / ゲノム
Research Abstract

本年度はこれまで開発してきたThermococcus kodakaraensisのin vitro翻訳系を用いて、オペロン構造を有する複数遺伝子の翻訳を試みた。対象オペロンにはT.kodakaraensisのアントラニル酸合成酵素をコードするtrpEGオペロンを選択した。TrpEとTrpGは会合体を形成し、これによりグルタミンをアンモニア供与体とするコリスミ酸からのアントラニル酸合成が進行する(AS複合体活性)。trpEGオペロンに相当するmRNAを調製しtrpEG欠損株由来のS30画分を用いて、in vitro翻訳反応を行った。その結果、反応溶液内にTrpE活性が観察され、またウエスタンブロット解析によりTrpGタンパクの合成が確認できた。さらに、溶液内にAS複合体活性が検出されたことから、無細胞合成されたTrpEはTrpGと複合体を形成していることが判明した。この結果により、本系によりヘテロ複合体を形成するタンパク質など、より広範囲なタンパク質合成が可能であることが示された。
さらに、リボソーム内空間を反応場として用いた無細胞タンパク質合成を試みた。T.kodakaraensis由来in intro翻訳系を内包するリボソームを界面通過法により作製し、その内部でのGFPの合成を試みた。
合成反応終了後のリボソームを共焦点レーザー顕微鏡下で観察したところ、GFP由来と考えられる蛍光が観察されたことから、実際にリボソーム内でタンパク質合成反応が進行することが示された。本結果は、将来的な機能性リボソームの構築に向けた基盤となる結果と言える。

  • Research Products

    (7 results)

All 2010 2009 Other

All Journal Article (4 results) (of which Peer Reviewed: 4 results) Presentation (2 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Identification of the Phr-dependent heat shock regulon in the hyperthermophilic archaeon, Thermococcus kodakaraensis2010

    • Author(s)
      Kauai T, Imanaka T, et al.
    • Journal Title

      J.Biochem. 147

      Pages: 361-370

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Characteristic effect of an anticancer dinuclear platinum(II)complex on the higher-order structure of DNA2010

    • Author(s)
      Kida N, Imanaka T, et al.
    • Journal Title

      J.Biol.Inorg.Chem. (掲載決定(印刷中))

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Thermococcus kodakaraensis mutants deficient in di-myo-inositol phosphate use aspartate to cope with heat stress2010

    • Author(s)
      Borges N, Imanaka T, et al.
    • Journal Title

      J.Bacteriol. 192

      Pages: 191-197

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Protein synthesis in giant liposomes using the in vitro translation system of Thermococcus kodakaraensis2009

    • Author(s)
      Yamaji T, Kanai T, Imanaka T, et al.
    • Journal Title

      IEEE Trans.NanoBioscience 8

      Pages: 325-331

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Cell-free protein synthesis at high temperatures using the lysate of a hyperthermophile2010

    • Author(s)
      金井保
    • Organizer
      PepCon 2010
    • Place of Presentation
      Beijing, China
    • Year and Date
      2010-03-22
  • [Presentation] GFP synthesis in giant liposomes using the in vitro translation system of Thermococcus kodakaraensis2009

    • Author(s)
      金井保
    • Organizer
      MHS2009
    • Place of Presentation
      Nagoya, Japan
    • Year and Date
      2009-11-10
  • [Remarks]

    • URL

      http://www.ritsumei.ac.jp/lifescience/skbiot/imanaka/HPtop.html

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Published: 2011-06-16   Modified: 2016-04-21  

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