2006 Fiscal Year Annual Research Report

胚性幹細胞から分化誘導した腸管のペースメーカー制御機構を構築する

Research Project

Project/Area Number	17300130
Research Institution	Nara Medical University
Principal Investigator	高木都奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (00033358)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	三澤裕美奈良県立医科大学, 医学部, 教務職員 (50281275) 中川正奈良県立医科大学, 医学部, 助手 (20372857) 中山晋介名古屋大学, 大学院医学研究科, 助教授 (30192230) 中島祥介奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (00142381) 国安弘基奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (00253055)
Keywords	胚性幹細胞 / ペースメーカ細胞 / 壁内神経系 / 脳由来神経栄養因子 / カルシウムイメージング / 蠕動運動 / ニコチン受容体 / ムスカリン受容体
Research Abstract	前年度の成果をふまえ、Embryoid body(EB)ballから腸管様器官(ES腸管)を作製する。GFP遺伝子を導入していないES細胞はCaイメージング用として用い、その他はGFP遺伝子を導入したES細胞を用いた。ES細胞の未分化維持のための培養は、10%FBS/ES-DMEM培養液に分化抑制因子としてleukemia Inhibitory Factor(LIF)を添加し、5%CO_2の条件下でインキュベートする。EB ballは、LIF無添加培養液を用いてPetri dish上でES細胞を浮遊培養して、作製した。その際に、ES細胞を浮遊培養する培地にBrain derived neurotrophic factorを加えた。5-6日後にLIF非存在下でEBを回収し、付着培養した。培養14--28日で動き始めるES腸管には壁内神経系とICCを兼ね備えたペースメーカ制御機構を構築することができた。その検証のためこれらのES腸管の神経細胞(PGP9.5、NF)やICC(c-kit)の免疫染色を行った。さらに、Caイメージングシステムを駆使して、培養14-28日の比較的動きの弱いES腸管を使ってFluo-3をロードしてCa振動や神経刺激により誘起されるCa上昇反応を測定した。神経刺激により誘起されるCa上昇反応についてはテトロドトキシン、ヘキサメソニウム、アトロピンを作用させ、ニコチン受容体、ムスカリン受容体の発現を確認した。さらに並行して、ICCの分化誘導の阻害と自発運動の関係を見るためにtyrosine kinase inhibitor, Imatinibを培地に加え、ICCの分化誘導の阻害を試みた。2年間の研究の結果を統括するとES腸管が蠕動運動を発生するには壁内神経系とICCを兼ね備えたペースメーカ制御機構の構築が必須であると結論される。