2005 Fiscal Year Annual Research Report
メタゲノムからの生分解性プラスチック分解遺伝子の探索とモノマーリサイクルへの応用
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17350077
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
中島 敏明 筑波大学, 大学院・生命環境科学研究科, 助教授 (80241777)
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| Keywords | メタゲノム / 生分解性プラスチック / モノマーリサイクル |
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| Research Abstract |
本研究では環境中から直接抽出したDNAを用いてメタゲノムライブラリーを構築し、新規な分解性プラスチック分解酵素遺伝子の取得を試みた。
対象分解性プラスチックとしてポリ乳酸(PLA)を用いた。コンポスト中ではPLAは通常よりも容易に分解されるという知見から、土壌サンプルにはコンポストを採用した。まず、PLAディスクを用いたコンポストからのPLA分解菌(分解遺伝子)の集積を試みた。ディスク状に成形したPLAをコンポストへ埋設し、65℃にて10日間静置した後、PLA diskを採取し、その表面に付着した菌のDNAを直接抽出した。
次に、取得したDNAをSau3AIにて限定分解し、pUC18ベクターを用いたメタゲノムライブラリーを構築した。PLA分解活性のスクリーニングは、PLAエマルジョンを重層したLuria-Bertani(LB)寒天培地上で、clear zone形成能を有する株を検出することにより行った。メタゲノムライブラリー40,000株のスクリーニングの結果、PLA分解活性を示す株を7株取得した。その株が有するプラスミドをそれぞれpLA-M4,5,7,8,9,10,11とした。
各プラスミドの有するinsert DNAの塩基配列を決定し、BLASTX検索を行った。その結果、PLA分解酵素遺伝子と思われるORFを見出し、これらをそれぞれplaM4,5,7,8,9,10,11とした。これらの遺伝子はいずれもBacillus属のlipase遺伝子と最も高い相同性を示したが、アミノ酸配列においても50%以上の相同性を示す既知遺伝子は見られなかった。
これらのうち、plaM4を発現ベクターpET21a(+)に導入し、E.coli BL21(DE3)にて大量発現および発現タンパク質の精製を行った。精製PlaM4は70℃において最も高いエステラーゼ活性を有し、50℃にて2時間のインキュベーションを行った後でも、その活性を70%保持していた。このことから、PlaM4は熱安定性のPLA分解酵素であることが明らかとなった。
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