2006 Fiscal Year Annual Research Report
水素移動型バイオ不斉還元プロセスの高機能化と触媒酵素のライブラリー構築
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17360402
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| Research Institution | Toyama Prefectural University |
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Principal Investigator |
伊藤 伸哉 富山県立大学, 工学部, 教授 (90213066)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
牧野 祥嗣 富山県立大学, 工学部, 助教 (20347355)
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| Keywords | バイオ不斉還元 / 光学活性アルコール生産 / バイオリアクター / 進化分化工学 / 有機溶媒耐性酵素 / メタゲノム / 遺伝子ライブラリー |
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| Research Abstract |
PARを進化分子工学的手法にて改良した変異酵素Sar268と、Sar268より活性が向上したHar1を得た。両酵素の機能解析を行った結果、明らかに極性溶媒中での活性が向上していた。極性溶媒中での酵素反応は、生体触媒反応の応用においてきわめて重要な研究であるが、これまでに、こうした酵素の改変成功例はほとんど見当たらない。現在、その機能解析とこれら触媒を用いた効率的光学活性アルコール生産に関するデータを蓄積している。さらに、Sar268およびLSAD組換え酵素を菌体のまま2-官能性試薬を用いて固定化し、これらの生体触媒を用いて一部の水溶性の高いケトンの立体選択的還元プロセスを流動層型のリアクターで行い、生産性約50g/Lにて500時間以上の運転が可能であることを証明した。
PARならびLSADHは、広い基質特異性、高立体選択性、自身の反応で補酵素も再生できるという極めてユニークかつ優れた酵素であることから、類縁酵素遺伝子の土壌からの網羅的分離を行い、PARとLSADHの基質特異性が異なる酵素ライブラリー構築を目指した。土壌からのメタゲノムの単離技術は昨年度確立した、次に、PARのN-/C-末端の相同性の高い内部配列をプライマーとして増幅を行い、生成したDNA断片を解析し、PARの類縁酵素遺伝子の取得に成功した。また、これら断片を導入し、完全長の酵素遺伝子を発現できるベクターを作製し、数種の類縁酵素を得た。現在この数を増やしている。またこうしたカセット法とは、異なる手法にてLSADHのメタゲノムライブラリーの作製を試みた。LSADH生産菌の類縁菌ゲノム情報を基にして、LSADHのN-/C-末端の相同配列縮重プライマーを設計し、これを基にメタゲノムからLSADHと類似の立体選択性と特異性を有する約30種のライブラリー調製に成功した。現在、これらを用いて一部のライブラリー評価を行っている。
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