難分解性環境汚染物質分解酵素創製のための新規メタ開裂酵素の構造と機能解析

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17380056
• Research Institution: Shibaura Institute of Technology
• Principal Investigator: 大森 俊雄 芝浦工業大学, 工学研究科, 教授 (20011984)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 羽部 浩 (独立法人)産業技術総合研究所, 研究員 (20313075)
• Keywords: メタ開裂酵素 / X線結晶構造解析 / カルバゾール / 海洋性細菌 / ジベンゾフラン

Research Abstract

(1)P.resinovorance CA10株のメタ開裂酵素(CarBaBb_<CA10>)のX線結晶構造解析
最終的なCarBaBb立体構造はRefmac5(CCP4)を使用して精密化し決定した(分解能:1.6Å、R因子:19.7%、R_<free>因子:22.1%)。また、精密化された分子モデルをProcheckで評価した結果、全てのアミノ酸残基が理想値の範囲であった。立体構造を明らかにした結果、CarBaBbは非対称単位中にα_2β_2の状態で存在しており、その大きさは約80×60×65Åであった。CarBaはCarBbの上に蓋のような形で存在しており、相互作用領域の解析結果より、tetramer中でCarBaは59-69および75-87の領域でCarBbと結合しており、2つのCarBb同士は59-65および100-112の領域で結合していた。一方、CarBa同士は直接的な結合を形成しでいなかった。αβサブユニットを1つの構成単位(dimmer)として、非対称単位中に存在する2つのdimerを重ね合わせた結東、Cα(347aa)におけるrms deviationは0.009Å、ems angleは1.182°であった。基質導入時の活性中心近傍の変化を明らかにするため、現在ソーキング法にて基質の導入を試みている。
(2)新規カルバゾール、ジベンゾフラン分解菌のスクリーニング
カルバゾール、ジベンゾフラン等の難分解性化合物を唯一の炭素源に用い、様々な地域の海水を菌源として集積培養し純化した結果、11菌株の海洋性難分解性化合物資化菌を単離することに成功した。その中のWA株とOC4株の16SrDNAを解析した結果、それぞれAlpha proteobacterium属とErythrobacter属に最も高い相同性を示した。WA株、OC7株で生育基質特異性を確認した結果、数種類の難分解性化合物での生育が確認された。サザンハイブリダイゼーションを行った結果、OC5S株は既知のカルバゾール分解初発酸化酵素とハイブリダイズした。

Research Products

• [Journal Article] Detection of a bacterial group within the phylum Chloroflexi and reductive-dehalogenase-homologous genes in pentachlorobenzene-dechlorinating estuarine sediment from the Arakawa River, Japan. (2006)
  • Author(s): Santoh, K., Kouzuma, A., Ishizaki, R., Iwata, K., Shimura, M., Hayakawa, T., Hoaki, T., Nojiri, H., Omori, T., Yamane, H., Habe, H.
  • Journal Title: Microbes Environ 21, Pages: 154-162
• [Journal Article] Improving the catalytic efficiency of meta-cleavage product hydrolase(CumD) from Pseudomonas fluorescens IP01. (2006)
  • Author(s): So-Yooung, J., Fushinobu, S., Nojiri, H., Omori, T., Shoun, H., Wakagi T.
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica Act 1764 Pages: 1159-1166
• [Journal Article] Differentiation of carbazole catabolic operons by replacement of the regulated promoter via transposition of an insertion sequence. (2006)
  • Author(s): Miyakoshi, M., Urata, M., Habe, H., Omori, T., Yamane, H., Nojiri, H.
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry 281 Pages: 8450-8457
• [Journal Article] Characterization of the replication, maintenance, and transfer features of the Inc P-7 plasmid pCAR1, which carries genes involved in carbazole and dioxin degradation. (2006)
  • Author(s): Shintani, M., Yano, H., Habe, H., Omori, T., Yamane, H., Tsuda, M., Nojiri, H.
  • Journal Title: Appl. Environ. Microbiol. 72, Pages: 3206-3216
• [Journal Article] Plasmid pCAR3 contains multiple gene sets involved in the conversion of carbazole to anthranilate. (2006)
  • Author(s): Urata, M., Uthimura, H., Noguchi, H., Sakaguchi, T., Eto, K., Habe, H., Ommori, T., Yamane, H., Nojiri, H.
  • Journal Title: Appl. Environ. Microbiol. 72, Pages: 3198-3205