TGF-βシグナルを制御するユビキチンリガーゼの異常と癌のメカニズムに関する研究

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17390354
• Research Institution: Fukushima Medical University
• Principal Investigator: 竹之下 誠一 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (10167489)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 竹林 勇二 福島県立医科大学, 医学部, 講師 (70321982)
• Keywords: TGF-β / 癌 / 転写活性 / ユビキチンリガーゼ

Research Abstract

TGF-βは多くの細胞の増殖を抑制することから、癌抑制因子として知られている。一方で細胞外マトリックスの蓄積や血管新生、免疫抑制などを引き起こすことから、癌化を促進する因子としても注目されている。抑制型SmadであるSmad7および、そのユビキチンリガーゼであるSmurf1,Smurf2,Arkadiaの転写調節と蛋白発現調節を調べるため研究を計画し、以下の結果を得た。
(1)手術摘出標本から得られた検体(食道癌、胃癌、大腸癌、乳癌それぞれ50症例、原発性肝癌、転移性肝癌それぞれ20例)からRNAを抽出し、Real time RT-PCR法を用いてSmad7、Smurf1、Smurf2、ArkadiaのmRNA発現解析をおこない、発現の差異が認められた。
(2)Smad7,Smurf1,Smurf2,Arkadiaのプロモーターをクローニングし、ルシフェラーゼベクターおよびGFPベクターに組み込んだ。9×CAGAベクターおよびSmad7,Smurf1,Smurf2,Arkadiaのプロモーターが動作することを確認した。
(3)テトラサイクリン誘導型RNAiシステムの作製をおこなった。
大腸癌細胞株HCT116およびSW480にTetリプレッサー(TetR)を恒常的に発現させるベクターpcDNA6/TR(Promega)を導入しウエスタンブロット法にてTetRの発現を確認した。さらに、siRNA配列Smurf1(5'-AAGAACCUUGCAAAGAAAGA),Arkadia(5'-AAGUGGGGAAUGAAUUCUCUC)を含むTetオペレーターをもつ誘導型siRNAベクターpSUPERIOR(Oligo Engine)を遺伝子導入し、テトラサイクリン添加によるRNAi発現細胞株を作製した。
次年度は作製したベクターおよび細胞株を用い、詳細なプロモーター解析を行う予定である。