2006 Fiscal Year Annual Research Report
ライブセルイメージングによる遺伝子操作ブタ冠動脈攣縮機構の解明と麻酔薬作用の研究
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17390432
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| Research Institution | Wakayama Medical University |
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Principal Investigator |
畑埜 義雄 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (70115913)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
木下 浩之 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教授 (70291490)
水本 一弘 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教授 (50239258)
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| Keywords | 冠動脈 / Rho-キナーゼ / イソフルラン / フリーラジカル |
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| Research Abstract |
ケタミンで麻酔したブタの頸動脈を露出、切開し、脱血死させる。開胸後、心臓を摘出し、4℃に冷却したクレブス液に入れる。ついで、摘出した心臓より冠動脈(左冠動脈[前下降枝,回旋枝]、右冠動脈、内径約1.5mm)を分離し、周囲の脂肪および結合組織を十分に除去した。血管内皮細胞は,ピンセットなどを血管内腔に通過させて器械的に除去した。
冠動脈を約2mmの長さのリング状標本とし、酸素95%+炭酸ガス5%を通気した37℃のクレブス液中で等尺性張力変化を測定した。スフィンゴリピドの一種sphingosylphosphorylcholine(SPC,0.01-10μM)の累積適用で冠動脈は強い収縮反応を示した。SPCによる収縮の15分前より、揮発性麻酔薬セボフルラン(0.5-2MAC)または選択的Rho-キナーゼ拮抗薬Y27632(2μM)を冠動脈標本に付加した。セボフルラン、Y27632ともに、SPCによる収縮反応を有意に抑制した。
ついで、冠動脈標本をSPCで処置し、この時に平滑筋内のRhoA、Rho-キナーゼ活性が増大するか否か、またセボフルランあるいはY27632処置がこれらのキナーゼ活性に影響を及ぼすか否かをウエスタンブロット法で測定した。この際、膜分画と細胞質分画に分けて、それぞれの分画中のRhoA、Rho-キナーゼ活性を測定した。セボフルラン(2MAC)またはY27632(2μM)は、SPC処置で増強した平滑筋内のRhoA、Rho-キナーゼ活性をほぼ同程度に抑制した。
共焦点レーザ走査型顕微鏡一式が入荷後、調整が終了し、現在、hydroethidine(2μM)による血管平滑筋内のフリーラジカル産生の有無を検討する準備を行っている。今後は、最近注目されているRho-キナーゼ活性に伴う細胞内フリーラジカル産生とそれに及ぼす麻酔薬作用を辞価する予定である。
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