2005 Fiscal Year Annual Research Report
健康推進活動を目指す疾患関連遺伝子の新規網羅的変異部位釣り上げ法の開発と応用
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17500496
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | National Cardiovascular Center Research Institute |
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Principal Investigator |
高木 敦子 国立循環器病センター(研究所), 薬理部, 室長 (90179416)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
池田 康行 国立循環器病センター(研究所), 病因部, 室長 (90176107)
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| Keywords | 変異 / ヘテロ接合体 / リポ蛋白リパーゼ / カルボジイミド / ヘテロ2本鎖DNA |
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| Research Abstract |
【目的】未知疾患関連遺伝子変異検出を可能とする次世代検出法(網羅的変異部位釣り上げ法)開発を目的とする。【方法】ヘテロ接合体を熱処理後徐冷し、ミスマッチ部位を形成し、これをビオチン化カルボジイミド(チミンあるいはグアニンを含むミスマッチ部位に特異的)で修飾し、アビジンを用いて釣り上げ、釣り上げたDNA断片をクローニングして、その塩基配列を解析し、ヘテロ部位を決定するものである。モデル遺伝子として血清トリグリセリド分解に関わるリポ蛋白リパーゼ(LPL)遺伝子を用いた。【成果1:2本鎖DNA形成効率の検討】Cy5標識DNA断片を95℃にて熱変性→徐冷後形成される2本鎖DNA(dsDNA)と1本鎖DNA(ssDNA)をSSCP法で検出した。高濃度のDNA(28ng/ul以上)を用いる熱変性→徐冷法では、ほとんどがdsDNAとして検出が、低濃度DNAでは、15%がdsDNAであった。【成果2:ヘテロ2本鎖DNA形成効率の検討】ヘテロ2本鎖DNA検出を容易にするため、4及び8塩基ミスマッチ(テトラリピート10、11、12回多型)を使用した。上記方法により、ヘテロとホモ2本鎖DNA分離が明らかに認められ、ヘテロ2本鎖DNAは約40%形成された。理論的には、ヘテロ2本鎖DNA形成率は50%が最大なので、本実験に用いたヘテロ2本鎖DNA形成方法は満足できるものであった。【成果3:ヘテロ2本鎖DNAへのビオチ化カルボジイミドの反応性】0℃と25℃において野生型とヘテロ型でビオチ化カルボジイミドの反応性の差異がドットブロット法で検出できなかったので、新規試薬であるインターカレーターFNDの共存が必須と考えられた。【成果4:LPL新規変異検出】多型の位置による釣り上げ効率に違いがあるのか否か等の検討のために新規変異の集積は重要である。LPL機能欠損となる新規変異を見いだし、特許出願準備中である。
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Research Products
(2 results)
