2006 Fiscal Year Annual Research Report
健康推進活動を目指す疾患関連遺伝子の新規網羅的変異部位釣り上げ法の開発と応用
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17500496
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| Research Institution | National Cardiovascular Center Research Institute |
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Principal Investigator |
高木 敦子 国立循環器病センター(研究所), 薬理部, 室長 (90179416)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
池田 康行 国立循環器病センター(研究所), 病因部, 室長 (90176107)
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| Keywords | 変異 / ヘテロ接合体 / リポ蛋白リパーゼ / カルボジイミド / ヘテロ2本鎖DNA / MutS / メタボリックシンドローム |
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| Research Abstract |
【目的】未知疾患関連遺伝子変異検出を可能とする次世代検出法(網羅的変異部位釣り上げ法)開発を目的とする。
【方法】ヘテロ接合体を熱処理後徐冷し、ミスマッチ部位を形成し、これをビオチン化カルボジイミド(チミンあるいはグアニンを含むミスマッチ部位に特異的)で修飾し、アビジンにて釣り上げた。モデルとしてメタボリックシンドロームに認められる高トリグリセリド(TG)血症の病因遺伝子のひとつのリポ蛋白リパーゼ(LPL)遺伝子を用いた。
【成果1】昨年度に検討した効率よい2本鎖DNA形成条件下で、ヘテロ2本鎖のミスマッチ部分のGとTをビオチン化カルボジイミド標識した。非特異的反応を抑制するために、マッチした2本鎖DNAに入り込む縫い込み型インターカレーターであるナフタレンジイミド(NDI)又はフェロセン化ナフタレンジイミド(FND)を共存させたが、ヘテロ特異的シフトバンドは得られなかった。電荷等異なる他のインターカレーターの合成と使用が必要と考えられた。
【成果2:MutSの精製】ヘテロ2本鎖DNAの釣り上げのため、上記以外の系として、MutSを選んだ0好熱性細菌Thermus thermophilus HB8のゲノムからMutS遺伝子をpET2l(a)ベクターにタローニングし、大腸菌内で発現させ、C末端に付加した6つのヒスチジン残基の性質を利用して、金属キレートアフィニティーカラムに結合させ、イミダゾールで溶出し、精製した。
【成果3:MutSによるヘテロ2本鎖DNAの釣り上げ】MutS蛋白で、我々が集積してLPL遺伝子変異のヘテロ2本鎖DNAの釣り上げを試みた。変異が集中するエキソン5についてみたところ、G188Eのヘテロが釣り上げられた0この変異はG→Aの変異であるが、G→Aの変異でも釣り上げられないものもあった。MutSの系での、NDIやFND又は新規物質を使用した検討が必要である。
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