土壌汚染修復のためのピレン分解菌モニタリング用プローブの開発と菌の活性化

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17510073
• Research Institution: Tokyo University of Science
• Principal Investigator: 峯木 茂 東京理科大学, 理工学部, 准教授 (40120216)
• Keywords: pyrene / Mycobacterium / dioxygenase / 16S-rRNA / FISH

Research Abstract

ピレン資化性細菌Mycobacterium sp. H2-5を無機培地でピレンを炭素源として培養し、ピレン分解に関与するジオキシゲナーゼ(ピレン酸化酵素)のサブユニットであるNidAとNidBを取得した。アミノ酸シークエンサー(現有)でN末端付近のアミノ酸配列を読むとともに、アミノ酸配列情報からPCR用DNAプローブを作製し、PCR(現有)によって当該タンパク質の遺伝子nidAとnidBを獲得し、塩基配列を決定した。次いで、その配列のDNAを蛍光標識して、本年度申請のオリンパス社蛍光顕微鏡を用いてFISH解析(fluorescence in situ hybridization)する予定であったが、標的となるmRNA量が少ないためにやや難しいと考えられたので、先ず手始めに豊富に存在すると考えられる、16S rRNAに対するFISHを試みることにした。
H2-5株のFISHに先立ち、E.coliに対して、Alexa Fluore 488で5'末端を蛍光ラベルしたユニバーサルプローブEUB338およびアンチセンスであるNONEUBを用いてFISHを行った。先ず、菌体をパラホルムアルデヒドで固定し、ゼラチンコートしたスライド上に結合させた。次に、上記プローブをハイブリしたのち、本研究助成金で購入した蛍光顕微鏡(カールツアイス社製)で観察した結果、EUBとDAPIに関して、明瞭なシグナルをうることができた。次いで、TSB栄養培地で純粋培養したH2-5株のFISHを同様な方法で行った。
その結果、EUB338とDAPIで強いシグナルが得られたものの、E.coliに比べると不明瞭であった。これはプローブの菌体内への浸透が不十分なためと考えているが、現在、酵素処理等で浸透性を向上させるべく、実験中である。