2005 Fiscal Year Annual Research Report
動原体構造異常オオムギ染色体を利用した機能的な動原体DNA配列の特定
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17570005
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
那須田 周平 京都大学, 農学研究科, 助手 (10273492)
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| Keywords | オオムギ / 動原体 / 染色体突然変異 / クロマチン / 免疫沈降 |
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| Research Abstract |
オオムギの機能的動原体配列を特定するため次の実験を行った。
(1)正常オオムギ系統の動原体領域に存在するDNA配列の特定。
高等生物の機能的動原体にはCENH3と呼ばれるピストンH3のヴァリアントが存在する。米国のP.Talbert博士よりイネのCENH3に対する抗体の分譲を受け、この抗体を用いた間接蛍光抗体法によりオオムギにおけるCENH3の染色体局在を確認したところCENH3は機能的動原体が形成される一次狭窄に局在することが明らかになった。さらに、同抗体を用いてクロマチン免疫沈降法を行った。その結果、正常オオムギ染色体の機能的動原体部位においてCENH3はオオムギでこれまで報告されてきた動原体特異的反復配列である(AGGGAG)nサテライト配列とcerebaレトロトランスポゾンと相互作用していることが明らかになった。スロットハイブリダイゼーションにより、抗CENH3タンパク質抗体による免疫沈降物にはcerebaレトロトランスポゾンと比較して(AGGGAG)nサテライト配列のほうが量的に多く含まれていることが示された。この結果は、スピンドルチェックポイントタンパク質であるMAD2が(AGGGAG)nサテライト配列と共局在するという細胞学的観察と矛盾しない。
(2)動原体領域に構造異常を持つオオムギ染色体7HS*を用いた解析
構造異常オオムギ染色体7HS*は上述の(AGGGAG)nサテライトもcerebaレトロトランスポゾンもFISHレベルで検出されない。この染色体の動原体領域に存在するDNA配列を特定するため、マイクロダイセクションした7HS*染色体末端をDOP-PCR法で増幅しプラスミドベクターに組み込んだ。このライブラリーからランダムに選択したクローンの塩基配列解析を開始した。また、オオムギ7H染色体の動原体領域に切断点を持つテロソームをEST配列のマッピングにより解析したところ、7HS染色体の動原体を挟む2個のEST配列を特定した。興味深いことに、短腕側の動原体に至近のEST配列は7HS*染色体で保持されており、7HS*染色体が複数の染色体変異の結果生じたことが明らかになった。
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