2006 Fiscal Year Annual Research Report
ヒトDNA複製前複合体の無細胞系での部位特異的な再構築
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17570125
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research |
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Principal Investigator |
森山 賢治 (財)東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 研究員 (00250217)
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| Keywords | 染色体複製 / 複製前複合体 / 無細胞系 / 複製起点 / EBウィルス |
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| Research Abstract |
Epstein-Barrウィルスの潜伏感染期ゲノムDNAはウィルス由来のタンパク質EBNA-1の存在下で1細胞周期に1回複製され、その複製開始や進行は宿主由来の因子(Orc, Mcmなど)に依存すると考えられている。私は、EBウィルスのoriPを持つプラスミドをモデルレプリコンとして'in vitroでのヒトDNA複製反応系の構築を目指している。oriPにOrc複合体, Cdc6, Cdt1, Mcm複合体から成る複製前複合体(pre・RC)が形成されるにはEBNA-1タンパク質がoriP上の特定配列(DSE)に結合することが必要不可欠である。また、DSE上にOrcが会合するのに必要な因子としてTRF2タンパク質が最近同定された。そこで、EBNA-1, TRF2, Orc1やCdc6等の組換え体タンパク質をヒト培養細胞に大量発現させ、その核抽出液を用いてoriP上にin vitroでヒトpreRCを構築する試みを種々の条件で実施した。その結果、OrcのコアサブユニットはEBNA-1, TRF2, Orc1の3者に依存してoriP断片や短いDSE断片に会合し、Cdc6も同様の挙動を示した。DSEを欠失したoriP断片にはOrcのコアサブユニットは結合しなかった。その一方、Mcm複合体の複製起点への会合に必要なもう一つのタンパク質Cdt1のoriP断片への結合はFBNA-1のみに依存し,TRF2やOrc1を大量発現させた核抽出液を加えても結合量は増えなかった。そのうえ、意外なことに、Cdt1はDSEを欠失したoriP断片にもEBNA-1に依存して結合することが判明した。現在、Cdt1過剰発現細胞の核抽出液の利用や、細胞周期を同調させて抽出液を調製するなどしてEBNA-1に依存した無細胞系でのpreRC再構築完成を目指している。
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