PNA-PCRクランピング技術を用いた植物根圏の糸状菌フロラ解析法の確立

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17580053
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 境 雅夫 鹿児島大学, 農学部, 助教授 (20225775)
• Keywords: 土壌微生物 / PNA / 植物根圏

Research Abstract

土壌の微生物群集の解析には,培養することなく,直接抽出した核酸をPCR法で増幅して解析する手法が多く用いられている。しかし,この方法を植物根圏の微生物群集に適用する場合には,植物由来の核酸の混入が,障害となってくる。すなわち,特異的なPCRプライマーが存在しないため,微生物群集のSSU rDNAをPCR増幅する場合,同時に植物由来のSSU rDNAも増幅され,その解析が妨げられる。そこで,本研究では,植物根圏の微生物群集とくに糸状菌群の解析法を確立するため,PNA(Peptide Nucleic Acid)によるPCRクランピング法を組み合わせることにより,この障害を回避することを目的とした。
前年度に,SSU rDNAの配列データベースが充実している細菌を対象として,群集解析に適用可能なPNAとして,植物ミトコンドリア特異的PNA(Mit1492)およびプラスチド特異的PNA(Pla1492)を作製した。そこで今年度は、これら2種類のPNAを用いた植物根圏の細菌群集構造解析法の有効性を確かめるために,土壌で栽培した植物根圏からビーズ法で直接抽出したDNAをサンプルとして,T-RFLP法にて根圏の細菌群集構造の解析をおこなった。従来のT-RFLP法では,植物オルガネラSSU rDNAの大きなT-RFピークが細菌群集構造の解析を妨げた。一方,PNA-PCRクランピングによるT-RFLP法では,植物根由来のDNAの影響を受けることなく,細菌DNAのみを解析できることが確認できた。しかしながら,糸状菌群集解析への適用については,適したPNAを作製することができなかった。
PNA-PCRクランピング技術は,植物根圏の細菌群集構造を解析する場合に,有効な手法であることが示されたが,糸状菌群集についてはさらに検討する必要性が示唆された。