2006 Fiscal Year Annual Research Report
新規ヘム酵素アルドキシム・デヒドラターゼの機能、多様性および生理学的意義の検討
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17580069
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| Research Institution | Faculty of Engineering, Toyama Prefectural University |
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Principal Investigator |
加藤 康夫 富山県立大学, 工学部, 助教授 (20254237)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
浅野 泰久 富山県立大学, 工学部, 教授 (00222589)
米田 英伸 富山県立大学, 工学部, 講師 (50285160)
青野 重利 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(岡崎統合共通研究施設), 岡崎統合バイオサイエンスセンター, 教授 (60183729)
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| Keywords | アルドキシム / ニトリル / アルドキシム-ニトリル経路 / 酵素 / 遺伝子 / スクリーニング / 微生物 / 反応機構 |
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| Research Abstract |
1)アルドキシム・デヒドラターゼの反応機構の解明
各種微生物由来のアルドキシム・デヒドラターゼを、EPR(電子スピン共鳴)、共鳴ラマン、電子吸収スペクトル等の分光学的手法により解析した。これらのスペクトルデータを平成17年度の研究により明らかにされた、Bacillus由来のアルドキシム・デヒドラターゼのそれと比較することで、本酵素に共通なヘムの配位状況、ヘム鉄の酸化度やスピン状態を決定し、これにより酵素反応時に関与する触媒残基の推定を行った。
2)「アルドキシム-ニトリル経路」の分布
以前の研究で選出された、「アルドキシム-ニトリル経路」を有する菌株において、同経路に存在すると想定される、ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ/アミダーゼといったニトリル分解酵素群の存在を、酵素・遺伝子的に検討した。オリゴヌクレオチドプライマーの設計の際、ニトリルヒドラターゼに関しては相同性が高いといわれているα-サブユニット間における相同領域を用い、ニトリラーゼに関しては既存のニトリラーゼとのみならず、近年報告された環境DNAからのランダムスクリーニングにより得られた多様性に富むニトリラーゼ遺伝子情報を参考にした。これらのプライマーを用い、サザンハイブリダイゼーションまたはPCRにより各遺伝子の存在を証明した。得られた目的断片をクローニング後、常法により塩基配列を決定し、さらにハイブリダイゼーション法やインバースPCR法にて同経路遺伝子クラスターをクローニングした。各酵素遺伝子を大腸菌中で大量発現させ、精製して諸性質の検討を行い、既知の情報と比較検討した。
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