2005 Fiscal Year Annual Research Report
キチンの高度有効利用に役立つ海洋生物由来キチン分解酵素の構造と反応機構の解析
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17580183
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
松宮 政弘 日本大学, 生物資源科学部, 助教授 (60150702)
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| Keywords | キチナーゼ / α-キチン / β-キチン / バイオマス / キチンオリゴ糖 / 基質分解特性 / N-末端アミノ酸配列 / 遺伝子 |
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| Research Abstract |
1.キチンオリゴ糖(GlcNAcn)を基質として魚類胃キチナーゼ(生理機能:消化)およびタバコスズメガ幼虫キチナーゼ(生理機能:脱皮)の基質分解特性を調べた。魚類胃キチナーゼにはα-キチン分解活性の強いマサバ(38kDa)およびアイナメ62kDa,β-キチン分解活性の強いアイナメ51および47kDaを、タバコスズメガ幼虫キチナーゼにはChi535(81kDa)およびC末端キチン結合ドメイン欠失のChi386(48kDa)を用いた。GlcNAcn(n=2-6)分解活性はHPLCにより分析した。マサバおよびアイナメ62kDaキチナーゼは4〜6糖(kcat:0.49-0.99)を分解して主に2,3糖を生成した。アイナメ51および47kDaキチナーゼは4〜6糖(kcat:1.9-5.8)以外に3糖も僅かに分解し、3,4糖より単糖も生成した。Chi535およびChi386も4〜6糖(kcat:0.11-0.29)以外に3糖も僅かに分解し、3〜5糖より単糖も生成した。餌料中の結晶性α、βキチンを消化分解する役割を果たすキチナーゼは比較的高い分子活性(kcat)を示し、エンド型で作用する傾向が強いこと、脱皮の機能を果たすキチナーゼの分子活性は低く、比較的ランダム型でオリゴ糖を分解すること、Chi535とChi386の基質分解特性は類似するが、Chi386では4糖分解能が半減することを明らかにした。
2.紅藻イボツノマタよりキチナーゼアイソザイムを精製し、それらの基質分解特性を検討した。得られたアイソザイムはいずれも、キチンオリゴ糖の非還元末端側より3糖以後のグリコシド結合を良く分解することを明らかにした。
3.アイナメ胃62kDaキチナーゼのN-末端アミノ酸配列およびファミリー18キチナーゼの保存配列より縮重プライマーを設計し、胃より調整したcDNAをテンプレートに用いてPCRを実施した。これより350bpの増幅を認め、この情報をもとにさらに約1.5kbpの増幅断片を得た。現在、その塩基配列を解析中。
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