2005 Fiscal Year Annual Research Report
RNA千渉技術を用いたヒト胎盤関門評価系における薬物透過機構の実証的解析
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17590136
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| Research Institution | Showa Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
渡辺 善照 昭和薬科大学, 薬学部, 教授 (70175131)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
近藤 昌夫 昭和薬科大学, 薬学部, 講師 (50309697)
藤井 まき子 昭和薬科大学, 薬学部, 助教授 (50199296)
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| Keywords | 遺伝子 / RNA干渉 / 胎盤関門 / 薬物透過機構 / 薬理学 |
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| Research Abstract |
本年度は、ファイバー改変型アデノウイルス(Ad)ベクターに搭載可能なsiRNA発現カセットの構築および最適化を行った。siRNA発現カセットの構築は国立医薬品食品衛生研究所水口裕之博士(現、医薬基盤研究所)との共同研究により開発してきたin vitro ligation法を用いており、siRNA発現カセットを構築した後、簡便にsiRNA発現Adベクターが作成可能となっている。siRNA発現カセットにおいては、ポリメラーゼIII系のH1プロモーターもしくはSP6プロモーターが主に使用されており、今回我々の研究において、H1プロモーターを用いたsiRNA発現カセットを搭載したAdベクターが脂肪細胞において目的の蛋白質をノックダウンすることを確認した。また、細胞株によって最適な発現系が異なることが知られており、ヒト胎盤細胞株において今後検討していく予定である。また、最近の報告により、ポリメラーゼII系(サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターなど)のプロモーターを用いたsiRNA発現カセットも開発されており、siRNAの発現制御や組織・細胞特異性を付与できる可能性が示されている。
そこで、ヒト胎盤細胞株をターゲット細胞とした機能的siRNA発現Adベクターの開発のため、まずはヒト胎盤細胞株において最も適したポリメラーゼII系プロモーターを検索した。つまり各種ポリメラーゼII系プロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を搭載したプラスミドをヒト胎盤細胞株(BeWo、JAR、JEG-3)にトランスフェクションし、ルシフェラーゼの発現量を指標に最も効率的な遺伝子発現コンポーネントを検討した。その結果、BeWo細胞ではSV40、CMV、PGKプロモーターにおいては遺伝子発現に大きな違いは見られなかったのに対し、JAR細胞ではPGKプロモーターで10倍以上の高い遺伝子発現が認められた。よって、細胞の違いにより最適なプロモーターが存在することが明らかとなった。また、初代培養細胞と類似した機能を示す分化型ヒト胎盤細胞への遺伝子導入において、ファイバー改変型Adベクターは従来型Adベクターの6倍以上の高い遺伝子導入効率を示すことを明らかとした。つまり、ファイバー改変型Adベクターはトロホブラスト培養細胞だけでなくヒト初代培養細胞への応用も期待できると考えられる。今後、これらベクターにポリメラーゼII系およびIII系のプロモーターを用いたsiRNA発現カセットを搭載させin vitroヒト胎盤関門評価系における機能解析を行う予定である。
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