2006 Fiscal Year Annual Research Report
血管平滑筋の形質変換時における筋線維の動的変化に関与する因子の検索
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17590218
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
岡垣 壮 三重大学, 大学院生物資源学部, 助教授 (80185412)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大井 淳史 三重大学, 大学院生物資源学部, 助手 (70203693)
中村 彰男 群馬大学, 大学院医学系研究科, 講師 (30282388)
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| Keywords | 血管平滑筋 / 形質変換 / 動脈硬化症 / ミオシン |
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| Research Abstract |
血管平滑筋は分化の進んだ筋線維の発達した「収縮型」、および未分化で増殖をする「合成型」の2種類の細胞に形質変換する。平成17年度までの研究で培養血管平滑筋細胞をPDGF処理によって合成型様細胞、酪酸ナトリウム(Na-butyrate,NaB)処理によって収縮型様細胞を作製し、それらの細胞に特異的な遺伝子のサブトラクションライブラリーを作成することによりスクリーニングした。PDGF特異的ライブラリーからは230クローンが、NaB特異的ライブラリーからは160クローンの遺伝子が特定できた。平成18年度にはこれらのクローンをナイロン膜にドットブロットした膜を4枚ずつ用意し、特異性を確認するため仮想的Northernハイブリダイゼーションをおこなった。使用したプローブは、サブトラクションした2種類のcDNA、およびサブトラクション前の2種類のcDNAである。その結果有意に特異性が認められたものがPDGF処理細胞では15クローン、NaB処理細胞では19クローンに集約された。そこでこれらのクローンに対してプライマーを作製し、リアルタイムPCRをおこなってPDGF処理細胞とNaB処理細胞での発現量に有意に差があるかを確認した。2種類の細胞で発現量の差が2倍以上認められたものはCa^<2+>結合蛋白質であるS100A4,S100A6、およびα-actinなどであった。そこでS100A4,S100A6の全長をクローニングし、大腸菌で発現蛋白質を作成した。さらにこの発現蛋白質とCa^<2+>依存的に相互作用する因子3種類を培養平滑筋細胞から単離することができた。これらについては現在アミノ酸シークエンスを決定する準備を行っている。今後は有意に発現量に差のあった残りのクローンについても同様な解析を続けていく予定である。
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