2006 Fiscal Year Annual Research Report

「ヘテロキャプチャー・サンドイッチEIA」の開発と環境ホルモンの検出

Research Project

Project/Area Number	17590281
Research Institution	Tokushima Bunri University
Principal Investigator	橋田誠一徳島文理大学, 健康科学研, 教授 (10156268)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	石堂一巳徳島文理大学, 健康科学研所, 教授 (40212906)
Keywords	ハプテン / 免疫測定法 / ファージディスプレイ / モノクローナル抗体 / ELISA
Research Abstract	「低分子抗原と第一抗体の複合体部位にのみ特異的に反応する第二抗体」を用い「免疫複合体転移法」と組み合わせることでハプテンをamolレベルで検出する新規の超高感度免疫測定法「ヘテロキャプチャー・サンドイッチEIA」を開発し、内分泌撹乱物質をはじめ、低分子物質の高感度検出を可能とする。モデル抗原としてE-64cを用いた。 1.モノクローナル抗E-64c Fab'の酵素標識体を調製 (1)E-64cに対するモノクローナル抗体を作成し、E-64cと結合するクローンを選択した。 (2)申請者らのヒンジ法を用い、Fab'-BSA-DNP, Bio及びFab'-酵素コンジュゲートを調製した。 2.ハプテン・一次抗体複合体特異Fabの調製 (1)固相上にE-64c-KLHを不溶化し、ついで、モノクローナル抗体を結合させ、E-64c・一次モノクローナル抗体複合体不溶化固相を作成した。 (2)ヒトFabを発現したファージライブラリーからE-64c・一次モノクローナル抗体複合体部位に特異的な抗体Fabを発現したファージのパニング。抗体提示ファージを(1)の固相と反応させ、抗原に結合するファージを選択し、これを3回繰り返し、特異的結合抗体提示ファージを得た。なお、非特異的反応を除去するためにE-64c-KLHb不溶化固相および一次モノクローナル抗体不溶化固相と反応する抗体提示ファージは除去した。 (3)スクリーニング現在、パニングで得られた抗体提示ファージを大腸菌に発現させ、この抗体のELISAを行い、上記と同様に抗原不溶化固相による特異抗体を選別している。選別後は、クローン重複がないかシーケンシングを行い、最終的には、大腸菌による抗体の産生、精製を行う。 3.上記特異的抗体による新規の高感度ハプテン測定法を開発し、キット化を目指す。