DNA損傷トレランスに関わる遺伝子REV7のノックアウトマウスの作成と解析

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17590340
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 村雲 芳樹 名古屋大学, 大学院・医学系研究科, 講師 (40324438)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 川井 久美 名古屋大学, 医学部附属病院, 助手 (50362231) ; 時々輪 真由美 名古屋大学, 大学院医学系研究科, 助手 (50378006)
• Keywords: REV7 / ノックアウトマウス / DNA損傷 / 損傷乗り換え型DNA複製

Research Abstract

平成17年度はREV7遺伝子のノックアウトベクターの作成と、ES細胞への導入、相同組み換え体の同定のためのスクリーニングを行った。REV7蛋白は、中央部に種々の蛋白との結合領域が存在しているので、その蛋白結合領域をターゲットとして変異マウスを作成することとし、その蛋白結合領域をコードしているエクソン3から6までを欠損させてneo遺伝子に置き換えるようにベクターを設計した。Mouse REV7 locusの塩基配列をdata baseより入手して、エクソン3より上流とエクソン6より下流のmouse genomic DNAをPCRにより増幅し、ノックアウトベクターのneo耐性遺伝子の上流と下流にそれぞれ挿入した。Negative選択マーカーとしてジフテリア毒素を用いた。作成したノックアウトベクターをES細胞にエレクトロポレーションにより導入し、G418を作用させた後にできたcolonyを約150個pick upし、genomic DNAを抽出して、相同組み換えが起こっていると考えられるcloneの同定を、PCR法を用いて行った。しかし、複数のPCR primerの組み合わせで検定したが、pick upしたcloneの中に相同組み換え体を同定することができなかった。現在、再度ノックアウトベクターをES細胞に導入して新たにcloneをpick upすることを行っている。同時に別のノックアウトベクターを作成して相同組み換え体の同定を試みることも検討している。