転写因子過給機構を備えた遺伝子発現システムの開発とDNAワクチンへの応用

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17590425
• Research Institution: YOKOHAMA CITY UNIVERSITY SCHOOL OF MEDICINE
• Principal Investigator: 佐々木 津 横浜市立大学, 医学部・客員準教授 (40342901)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 武下 文彦 横浜市立大学, 医学部, 準教授 (60333572)
• Keywords: DNAワクチン / 転写因子 / 遺伝子発現

Research Abstract

CMVプロモーター内に転写因子結合モチーフ(NF-κB、 AP-1、C/EBP、 CIITA、 IRF、 ISRE)をタンデムに5-7個連結した配列を挿入した。これらをプラスミドDNAに組み込み、下流にレポーター遺伝子(Luc、 SEAP、 LacZ)を挿入した。対応する転写因子の発現プラスミドを作製(NF-κB、 c-Fos、 c-Jun、 C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPγ、C/EBPδ、C/EBPε、ClITA、 IRF3、IRF7)した。レポータープラスミドと転写因子発現プラスミドを組み合わせて細胞にトランスフェクトし、レポーターアッセイを行い、良好な組み合わせを検討した。HEK293細胞においては、どの組み合わせも野生型CMVプロモーターと比べ強力にレポーター遺伝子の発現を増強した。筋肉細胞株C2C12ではAP-1結合モチーフを7個x3(AAA)組み込んだCMVプロモーターとc-Fos/c-Jun発現プラスミドの組み合わせが強力にレポーター遺伝子の発現を増強した。肝細胞株Hepal.6ではC/EBP結合モチーフを5個x3(CCC)組み込んだCMVプロモーターとC/EBPδプラスミドの組み合わせが強力にレポーター遺伝子の発現を増強した。実際に、生体内に筋注エレクトロポレーション法を用いてプラスミドを導入した場合にどの組み合わせが免疫原性増強に有効であるか検討するため、二重プロモーターベクター(抗原遺伝子と転写因子遺伝字を共発現させるベクター)を構築してマウスに投与した。AP-1結合モチーフを挿入したCMVプロモーターによる標的遺伝子発現カセットと、AP-1を共発現させることで、ヒトSEAP遺伝子の長期持続発現(6ヶ月以上)が確認された。また、ISREを挿入したCMVプロモーターは、従来型CMVプロモーターと比べて、強い免疫原性が得られた。これらのことからさまざまな転写因子結合モチーフを挿入したCMVプロモーターを用いることで、標的遺伝子産物に対する免疫原性を調節することが可能であることが示唆された。

Research Products

• [Journal Article] Muscle creatine kinase/SV 40 hybrid promoter for muscle-targeted long-term transgene expression (2007)
  • Author(s): Takeshita F, Takase K, Tozuka M, Saha S, Okuda K, Ishii N, Sasaki S
  • Journal Title: Int. J. Mol. Med. 19 Pages: 309-315
  • Description: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [Journal Article] Suppression of iodide uptade and thyroid hormone synthesis with stimulation of the type I interferon system by double-stranded RNA (dsRNA) in cultured human thyroid follicles. (2007)
  • Author(s): Yamazaki K, Suzuki K, Yamada E, Yamada T, Takeshita F, Matsumoto M, Mitsuhashi T, Obara T, Takano K, Sato K
  • Journal Title: Endocrinology (in press)
• [Journal Article] A fused gene of nucleoprotein (NP) and herpes simplex virus genes (VP22) induces highly protective immunity against different subtypes of influenza virus (2006)
  • Author(s): Saha S, Yoshida S, Ohba K, Matsui K, Matsuda T, Takeshita F, Umeda K, Tamura Y, Okuda K, Klinman D, Xin KQ, Okuda K
  • Journal Title: Virology 35 Pages: 48-57
  • Description: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [Journal Article] Multivalent DNA vaccine protects mice against pulmonary infection caused by Pseudomonas aeruginosa (2006)
  • Author(s): Saha S, Takeshita F, Sasaki S, Matsuda T, Tanaka T, Tozuka M, Takase K, Matsumoto T, Okuda K, Ishii N, Yamaguchi K, Xin KQ, Klinman DM, Okuda K
  • Journal Title: Vaccine 24 Pages: 6240-6249
  • Description: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [Journal Article] Activator protein 1-mediated transcriptional regulation strategy sustains long-term expression of a xenogeneic gene product in vivo : An implication for gene therapy targeting congenital protein deficiencies (2006)
  • Author(s): Sasaki S, Smith JM, Takase K, Okuda K, Ishii N, Takeshita F
  • Journal Title: Int. J. Mol. Med. 18 Pages: 289-297
  • Description: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [Journal Article] TLR-adaptor molecules enhance DNA-raised adaptive immune responses against flu and tumor challenge through the activation of innate immunity (2006)
  • Author(s): Takeshita F, Tanaka T, Matsuda T, Tozuka M, Kobiyama K, Saha S, Matsui K, Ishii KJ, Coban C, Akira S, Ishii N, Suzuki K, Klinman DM, Okuda K, Sasaki S
  • Journal Title: J. Virol 80 Pages: 6218-6224
  • Description: 「研究成果報告書概要(和文)」より