ES細胞の心筋細胞分化過程における心筋特異的GATA4複合体の解析

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17590770
• Research Institution: Research Institute for Production Development
• Principal Investigator: 森本 達也 (財)生産開発科学研究所, 心血管分子細胞生物学研究室, 主任研究員 (50390779)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 北 徹 京都大学, 大学院・医学研究科循環器内科, 教授 (60161460) ; 尾野 亘 京都医療センター臨床研究センター, 展開医療研究部・生命情報科学研究室, 室長 (00359275)
• Keywords: ES細胞 / プロテオミクス / 心筋分化 / 転写因子

Research Abstract

(1)マウスES細胞における心筋分化に関するGATA4複合体の精製
心筋細胞分化におけるES細胞内の心筋特異的転写因子GATA4の機能的コンプレックスの精製を目的として、N末あるいはC末にFLAG-HAの二重タグの付いたマウスGATA4のcDNAをレトロウイルスを用いてES細胞に発現させることに成功した。しかし、ESが未分化を維持するためにはサイレンシングなどの機構により、蛋白レベルを調節していることはよく知られているが、その詳細なメカニズムは不明である。この未知のメカニズムのために、細胞を継代していくうちにGATA4の発現量が減少していき、GATA4複合体を精製するには、十分量なタンパク量を得ることができず、現在、誘導をかけてGATA4をES細胞に発現させる方法などを検討している。
(2)GATA4結合蛋白の機能解析
GATA4複合体を網羅的に解析するために、FLAG-HAの二重タグの付いたマウスGATA4のcDNAをレトロウイルスを用いてHeLa細胞に発現させ、核蛋白を抽出した。その後、FLAGとHAの抗体をもちいて、GATA-4複合体のタンデム・アフィニティー精製をおこない、結合蛋白をCBB染色にて確認した。マススペクトメトリーと蛋白データーベースから、GATA4複合体を構成する蛋白を網羅的に解析し、73個の結合蛋白を同定した。現在、興味有る結合蛋白の発現量、GATA4との結合の変化、心筋細胞特異的マーカーの発現や心筋特異的転写因子(βミオシン重鎖、エンドセリン1、ANP(Aタイプ利尿ペプチド)など)のプロモーターの転写活性の変化をルシフェラーゼアッセイにて測定している。結合蛋白の野生型やさまざまな変異体のリコンビナント蛋白を昆虫細胞や大腸菌を用いて作成中で、その結合が直接的なものか他の因子を必要とするかを検討し、ドメインマッピングも行う予定である。