2005 Fiscal Year Annual Research Report
VLaノックアウトマウスを用いた抗利尿ホルモン受容体機能解析と新たな利尿薬開発
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17590833
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
野々口 博史 熊本大学, 大学院・医学薬学研究部, 助教授 (30218341)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
冨田 公夫 熊本大学, 大学院・医学薬学研究部, 教授 (40114772)
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| Keywords | V2受容体 / V1a受容体 / プロモーター活性 / cAMP / プロテインキナーゼC / Gプロテイン |
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| Research Abstract |
尿濃縮の中核をなすバゾプレッシンの2種類の受容体のうち、V1a受容体はその機能がよくわかっていないが、V2受容体の機能調節を司っているというのが,我々の仮説である。
V1a,V2受容体の転写活性への相互作用については、LLC-PK1細胞にラットV1a受容体遺伝子を導入し、V1a受容体が存在することで,V2受容体のプロモーター活性が低下することを確認した。そこで、その詳しい機序に付いて、さらに検討を行なった。V1a受容体はGq11を活性化し、プロテインキナーゼCを活性化することが知られており、プロテインキナーゼCの刺激薬であるPMAによりV2受容体プロモーター活性が、低下することを確認した。PMA存在下では、バゾプレッシンによるcAMP産生も抑制されることから、V1a受容体への刺激が、PKCの活性化を介して、セカンドメッセンジャーであるcAMP産生の低下を来すことが、プロモーター活性抑制の鍵を握っていることが確認された。現在、細胞内カルシウム濃度の測定により、さらに確認実験中である。
この実験では、LLC-PK1細胞を用いたが、発現しているV2受容体は、豚V2受容体であるため、より、確実な実験のために、SV40トランスジェニックラットより、集合尿細管を単離、培養し、新たなcell lineを作製した。トランスジェニックマウスはよく行なわれているが、トランスジェニックラットでは、これまで報告はない。現在、V2,V1a受容体の遺伝子、蛋白発現の確認を、real time PCR,Western blot等において、検討中である。今後、その発現が確認されたならば、このcell lineを用いて、同様の実験を行ない、さらにRNAiを用いて、V1a受容体のない状態での、V2プロモーター活性の変化を測定する予定である。
V1a受容体ノックアウトマウスでは、尿の濃縮力や脱水、代謝性アシドーシスに対する反応では、大きな差はみられなかった。AVP感受性のcAMP産生についても検討したが、大きな差は見られなかった。そこで、V1a受容体トランスジェニックマウスでも、尿の濃縮力や脱水に対する反応では、大きな差は認めなかった。V1a受容体の生理的役割については、現在も、検討中である。
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