不死化細胞株を用いた食塩感受性因子腎カリクレイン合成分泌低下機構の解明と遺伝多型

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17590842
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 藤田 朋恵 北里大学, 医学部, 助手 (20296510)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 馬嶋 正隆 北里大学, 医学部, 教授 (70181641)
• Keywords: カリクレイン / 不死化遺伝子 / 食塩感受性 / 遺伝多型

Research Abstract

(1)SV40温度感受性T-抗原遺伝子導入によるトランスジェニックラットの作成
北里大学医学部実験動物センターにおいて、SHR、WKY、DS、DR各々について不死化遺伝子導入ラット作成を当初予定していたが、平成17年12月にベンチャー企業「株式会社ファクト」において、本遺伝子が導入されたトランスジェニックラットを提供できることになったことから、同動物を購入することに変更した。
(2)腎カリクレイン産生細胞株の作成
腎カリクレイン産生部位は、接合尿細管から皮質集合管に分布する接合尿細管細胞および主細胞に限局している。上記トランスジェニックラットを用いた接合尿細管の単離培養による不死化細胞樹立に先立って、正常動物(SDラット)を用いて、腎皮質部分をコラゲナーゼ処理した後、実体顕微鏡下で接合尿細管から皮質集合管部分の単離を試みている。現在、酵素処理条件、尿細管単離後の培養プレートへの接着の有無について検討している。
本方法で単離、培養が困難な場合、カリクレイン産生細胞の分布に一致し、かつ細胞膜表面上に発現する水チャネル(aquaporin2:AQP2)に対する抗体を用いた磁器細胞分離法によるカリクレイン産生細胞の単離を行う。ラット♂/3^-4wを24h渇水状態にし、内因性AQPの細胞膜上発現を増強させた後、両腎皮質から細胞を単離する。次に、ラットAQP2抗体、マイクロビーズ標識二次抗体で細胞を標識し、マグネットカラムで標識細胞を分離回収し、初代培養する。33℃で細胞をインキュベートすることによりSV40抗原を活性化し、不死化細胞を得る。カリクレイン産生細胞の確認には、抗カリクレイン抗体による免疫染色を行う。