2005 Fiscal Year Annual Research Report
新たに同定したPDE3B結合性リン酸化蛋白のクローニングと機能解析
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17590939
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
牧野 英一 愛媛大学, 医学部, 教授 (50009578)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大澤 春彦 愛媛大学, 医学部, 助教授 (90294800)
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| Keywords | PDE3B / 脂肪細胞 / インスリン / 燐酸化 / インスリン抵抗性 / 相互作用 |
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| Research Abstract |
脂肪組織における脂肪分解調節の破綻は血中遊離脂肪酸(FFA)の上昇をもたらし、その結果インスリン抵抗性が惹起される。インスリンの抗脂肪分解作用の機序としてインスリンによる脂肪細胞phosphodiesterase 3B(PDE3B)の活性化が考えられている。インスリンは、PDE3Bを燐酸化と共に活性化し、細胞内cAMP濃度の低下とホルモン感受性リパーゼの活性低下させ、中性脂肪の分解を抑制する。最近、ラット脂肪細胞において、インスリン依存性に燐酸化される分子量50kDaのPDE3B結合蛋白(p50)の存在を見出した。本研究ではp50をクローニングし、PDE3B,活性調節の分子メカニズムを明らかにすること目的とする。
本研究は、1)yeast two-hybridにて既に得られている候補クローンの網羅的解析、2)燐酸化p50の分離、質量分析による同定の2つからなる。平成17年度は、目的1を中心に進めた。
我々は、マウスPDE3Bをbaitとしたyeast two-hybridスクリーニングでPDE3Bに相互作用する14-3-3β蛋白を同定した。その際得られた陽性クローン中にp50が存在すると考えられる。今回、1次スクリーニング陽性の約80クローンについて2次スクリーニングを行い、陽性クローン11個を得た。これらのGST融合蛋白をE.Coliで合成し、reticulocyte lysateで合成した^<35>S標識PDE3Bとの相互作用をGST pull downにより検討した。その結果、11個のクローン全てについてPDE3Bとの相互作用をin vitroで認めた。
一方、ラット脂肪細胞において、インスリンによるp50の燐酸化がワルトマニンにより阻害されること、p50の燐酸化がセリンおよびすスレオニンのリン酸化であることを見出した。さらに、ゲルろ過等を用いて、p50とPDEのキナーゼ分画にAktが存在することを証明した。
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