新たに同定したPDE3B結合性リン酸化蛋白のクローニングと機能解析

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17590939
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 牧野 英一 愛媛大学, 大学院医学系研究科, 教授 (50009578)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大澤 春彦 愛媛大学, 大学院医学系研究科, 助教授 (90294800)
• Keywords: PDE3B / 脂肪細胞 / インスリン / 燐酸化 / インスリン抵抗性 / 相互作用

Research Abstract

本研究は、PDE3Bに相互作用しインスリンによりリン酸化されるp50のクローニングおよびそのその解析を目的とし、そのアプローチとしては1)yeast two-hybridにて既に得られている候補クローンの網羅的解析、2)燐酸化p50の分離、質量分析による同定を計画した。
平成18年度は、平成17年度に引き続き、yeast two-hybridにて既に得られている候補クローンの解析を主に行った。平成17年度にyeast two-hybridの2次スクリーニングおよびin vitroのreticulocyte lysateで合成した^<35>S標識PDE3Bを用いたGST pull downによりPDE3Bとの相互作用を確認した11クローンについて、ラット脂肪細胞の内因性PDE3Bとの相互作用の解析を行った。これら11クローンそれぞれのGST融合蛋白およびラット副睾脂肪細胞の可溶化膜分画を用いGST pull downを行い、抗PDE3B抗体を用いたWestern blot法ににより相互作用を検討した。その結果、11クローン中、キナーゼおよび転写因子を含む7クローンでラット脂肪細胞の内因性PDE3Bとのin vitroでの相互作用が確認された。
さらに、11クローンについてそれぞれの蛋白に対する抗体を、GST融合蛋白をウサギに免疫することにより作成した。これらの抗体を用いて、得られたクローンの脂肪細胞内でのPDE3Bとの内因性の相互作用について、免役沈降法、Western blot法により、一部を解析した。
本研究により、p50の候補としてキナーゼおよび転写因子を含む7クローンを限定した。さらに、本研究によりPDE3Bはp50および我々がすでに報告した14-3-3β以外に複数の蛋白と相互作用することが示唆された。