2006 Fiscal Year Annual Research Report
時計遺伝子(BMAL1、CLOCK)のPPARのプロモータへの作用
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17590947
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| Research Institution | Saitama Medical University |
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Principal Investigator |
井上 郁夫 埼玉医科大学, 医学部, 助教授 (60232526)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
池田 正明 埼玉医科大学, 医学部, 助教授 (80232198)
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| Keywords | PPARα / PPARβ / δ / PPARγ / BMAL1 / CLOCK / RORα / RORβ / REV-ERB |
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| Research Abstract |
以前クローイングしたPPAR群、BMAL1、CLOCK、ROR群、REV-ERB群が、それぞれ、蛋白-蛋白結合するかどうか、加えて、PPAR群のプロモーターがBMAL1、CLOCKによって変動するか検討した。pGEX-4TのBamH Iサイトにクローン化したPPAR群遺伝子を、GST-PPARs融合タンパク質としてEscherichia coliにおいて発現させ、ビオチン標識したin vitto translation(TNT T7 Coupled Reticulocyte Lysate System, Promega)BMAL1、CLOCK、ROR群、REV-ERB群、それぞれを2μL、および試験化合物の50mmol/L溶液を10μLを加えたNETN緩衝液1000μL中で、4℃で一昼夜実施した。恒温処理後、400〜1,000×gで3分間の遠心分離により上清を除去し、固定化した融合タンパク質を、ミルクを加えないNETN緩衝液で3回洗浄し、洗浄後、グルタチオン・セファロースに結合させたタンパク質を窒素ガス下で乾燥させてから、SDSサンプル緩衝液に再懸濁させ、SDS-PAGEで分析した。以上の実験より、明らかに、PPAR群とBMAL1、CLOCK、ROR群、REV-ERB群がそれぞれ、蛋白-蛋白結合することが判明し、加えて、PPAR群のプロモーターがBMAL1、CLOCKによって明らかに変動することも明らかとなった。
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