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2005 Fiscal Year Annual Research Report

新規甲状腺ホルモン受容体アイソフォームの同定と機能解析

Research Project

Project/Area Number 17590973
Research InstitutionDepartment of Clinical Research, National Hospital Organization Kyoto Medical Center

Principal Investigator

田上 哲也  独立行政法人国立病院機構(京都医療センター臨床研究センター), 内分泌研究部・分子内分泌研究室長 (60273439)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 森山 賢治  独立行政法人国立病院機構(京都医療センター臨床研究センター), 内分泌研究部, 研究員 (00301739)
成瀬 光栄  独立行政法人国立病院機構(京都医療センター臨床研究センター), 内分泌研究部, 部長 (40120018)
Keywords甲状腺ホルモン / 核内受容体 / 甲状腺ホルモン受容体 / クローニング / 転写因子
Research Abstract

1.TRβ4遺伝子発現ベクターの構築
機能解析を目的として、クローニングした遺伝子をCMX発現ベクターのMCSに挿入(サブクローニング)し、塩基配列をシークエンサーで確認した。
2.発現実験
リン酸カルシウム法を用いて、ヒト胎児腎臓由来の細胞(293T)に応答配列(TRE)をもつルシフェラーゼ発現リポーター遺伝子(TRE-tk-Luc)あるいはネガティブフィードバックをうける遺伝子(TSH-Luc)とともにコトランスフェクション(遺伝子導入)し,発現蛋白の転写機能を解析した。
その結果、TRβ4単独では、有意な転写活性は観察されなかった。
3.共発現実験
機能的TRであるβ1/2やTRα1とAF-2を培養細胞にトランスフェクションし、機能的TRの機能に対する影響を観察した。対照として不応症から同定された変異TRβ1(RTHβ)やTRα2とその作用を比較した。その結果、TRβ4はTRα2と同程度に、RTHβsより軽度に、機能的TRの転写活性化能を阻害した。
4.In vivo DNA結合能
Promoter interferenceアッセイ法を応用し、TRβ4のin vivoにおけるDNA結合性を検証した。TSHプロモーターのTATAbox下流にTREを挿入し、TRがDNA(TRE)に結合するとルシフェラーゼ活性が阻害されることで結合性を半定量した。その結果、対照として用いたTRβ1/2やTRα1/2と同程度のDNA結合性が観察された。
5.ノザンブロット
市販のヒトRNAパネルを用い、TRβ4特異的プライマーでハイブリダイズし、各組織におけるTRβ4mRNAの発現量を比較検討した。その結果、約7kb(主)と約3kb(従)のバンドが同定され、骨格筋での発現が最も多く、RT-PCRの結果と一致した。次いで、前者は心臓と脳に、後者は肝に豊富であった。

  • Research Products

    (3 results)

All 2005 Other

All Journal Article (3 results)

  • [Journal Article] A novel isoform of thyroid hormone receptor beta that does not bind T3.2005

    • Author(s)
      Tagami T, Moriyama K, Usui T, Nagata D, Shimatsu A, Naruse M
    • Journal Title

      The 7th international workshop on thyroid hormone resistance Syllabus

      Pages: 15

  • [Journal Article] Clinical and molecular features of a TSH-secreting pituitary microadenoma.2005

    • Author(s)
      Usui T, Izawa S, Sano T, Tagami T, Nagata D, Shimatsu A, Takahashi JA, Naruse M
    • Journal Title

      Pituitary 8

      Pages: 127-134

  • [Journal Article] Molecular mechanism of the inhibitory effect of aldosterone on endothelial nitric oxide synthase activity

    • Author(s)
      Nagata D, Takahashi M, Sawai K, Tagami T, Usui T, Shimatsu A, Hirata Y, Naruse M
    • Journal Title

      Hypertension (In press)

URL: 

Published: 2007-04-02   Modified: 2016-04-21  

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