2005 Fiscal Year Annual Research Report
βグロビン異常症の治療に道を開くγグロビン活性化因子の同定
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17590990
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
浅野 治彦 名古屋大学, 医学部附属病院, 助手 (10378060)
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| Keywords | 胎児型グロビン / zinc finger / 転写因子 / Tet Onシステム / 遺伝子発現 |
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| Research Abstract |
●ZFF29遺伝子の強制発現
N末端にFLAG tagを付加したFLAGZFF29aとFLAGZFF29bを、Neo^R遺伝子を有するbicistronic vectorに挿入しpNeo-IRES-FLAGZFF29aとpNeo-IRES-FLAGZFF29bを構築した。これらを赤血球系細胞株K562に導入しスクリーニングの後、限界希釈法によりFLAGZFF29を発現する細胞のクローニングを試みた。結果、それぞれについてウェスタン法で発現が確認できる複数のクローンを得た。異なったシステム、Tet Onシステム、によるZFF29遺伝子の発現系を構築した。すなわち、FLAGZFF29aとFLAGZFF29bをpTRE-Hygroに挿入しpTRE-FLAGZFF29aとpTRE-FLAGZFF29bを作製し、K562 Tet On細胞に導入、Doxycycline添加によりFLAG蛋白発現が誘導できる複数のクローンを得た。成体型転写環境とされているマウス赤白血病細胞株(MEL)においても同様の発現システムを構築中である。
●グロビン遺伝子発現の解析
当初はグロビンに遺伝子の転写産物の定量をprimer extension法により行う予定であったが一部の遺伝子で複数の転写産物が検出されたため定量性に問題有りと判断しRNase protection法で行う方針に変更した。ヒト遺伝子(ε,γ,β,ζ,αとコントロールとしてβ-actin)とマウス遺伝子(εY,βh1,βminor,βmajor,x,αとコントロールとしてβ-actin)に対するプローブを、PCRを用いて作製した。現在、それらプローブがmRNAを予想されたサイズのバンドとして検出するか確認中である。
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[Journal Article] Transcription factor specificity protein 1 (Sp1) is the main regulator of nerve growth factor-induced sphingosine kinase 1 gene expression of the rat pheochromocytoma cell line, PC122005
Author(s)
Sobue, S., K.Hagiwara, Y.Banno, K.Tamiya-Koizumi, M.Suzuki, A.Takagi, T.Kojima, H.Asano, Y.Nozawa, T.Murate
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Journal Title
J Neurochem 95
Pages: 940-949
