2005 Fiscal Year Annual Research Report
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17590996
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
柴山 浩彦 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (60346202)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
金倉 譲 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (20177489)
松村 到 大阪大学, 医学系研究科, 助教授 (00294083)
水木 満佐央 大阪大学, 医学系研究科, 講師 (80283761)
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| Keywords | 抗アポトーシス / アナモルシン / Yeast-two-hybrid法 / PICOT |
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| Research Abstract |
我々がクローニングした新規の抗アポトーシス分子アナモルシンは、既知のアポトーシス関連分子とは一切、相同性を示さず、これまでのところその作用機序に関しては不明であった。本研究では、アナモルシンの作用点を明らかにする目的にて、アナモルシンと結合する分子をYeast-two-hybrid法を用いてクローニングした。マウスのアナモルシン全長をベイトとして、アナモルシンを高発現している臓器である精巣から作製したcDNAライブラリーを用いて、アナモルシンと結合する蛋白をコードする遺伝子のスクリーニングをおこなった。
その結果、PICOT(thioredoxin-like2)という分子が有意にクローニングされた。PICOTは、PKCと結合する分子としてクローニングされた分子で、チオレドキシンにホモロジーをもつことが知られているが、アポトーシスに及ぼす影響の詳細については解析がなされていない。タグ付きのPICOTをマウス造血細胞株Ba/F3細胞に発現させ、タグの抗体で免疫沈降を行い抗アナモルシン抗体によりウェスタンブロットを行ったところ、PICOTとアナモルシンはBa/F3細胞内においても結合していることが確認された。PICOTの発現、機能を詳細に検討するためには、抗PICOT抗体が必要であるが、現在まで、入手可能な抗体がないため、我々は、PICOTに対する単クローン抗体を作製した。マウスとヒトのPICOTはアミノ酸配列の相同性が高いため、どちらのPICOTも認識できる抗体の作製を計画し、成功した。現在、作製した抗PICOT抗体を用い、蛋白レベルでの発現解析をおこなっている。また、PICOTの造血細胞のアポトーシスにおける機能を明らかにするために、PICOT発現ベクターを用い、種々の造血細胞株にPICOTを過剰発現させ、あるいは、RNA干渉を用い、PICOT発現をノックダウンすることにより、PICOTの機能解析をおこなっている。
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