2005 Fiscal Year Annual Research Report
単純ヘルペス感染により発症する多形紅斑の動物実験モデルの開発
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17591174
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
皆川 洋子 九州大学, 大学院・医学研究院, 助教授 (70209823)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
師井 洋一 九州大学, 大学病院, 講師 (40264022)
吉開 泰信 九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (90158402)
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| Keywords | 単純ヘルペスウイルス / 免疫学 / 遺伝子 / トランスジェニック動物 |
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| Research Abstract |
皮膚に限局してHSV-1エンベロープ膜タンパク糖タンパクB(glycoproteinB,gB)を発現するトランスジェニックマウスを作成する目的で、gB遺伝子をケラチンを発現する細胞でのみ活性化するK14プロモーターの下流に接続したDNAを以下のとおり作成した。
K14-MCP-1-hGH introns poly Aコンストラクトが入ったpGEMプラスミド(4784bp)は、コンストラクトの両端が制限酵素EcoRI切断部位になっており、MCP-1cDNA断片(534bp)はBamHI切断部位によりK14プロモーターとhGHイントロンに結合している。このプラスミドを大腸菌DH5αに導入し、アンピシリン選択培地を用いて組換え大腸菌を増殖し、プラスミドDNAを回収した。制限酵素EcoRIおよびBamHIで切断し、アガロース電気泳動でプラスミド導入が確認できた大腸菌を培養・精製して得たプラスミドDNAから、MCP-1領域を切出したDNA断片(6993bp)を準備した(BamHI消化→電気泳動→断片の精製)。一方HSV-1 gB498-505(SSIEFARL)領域を含むDNA断片は、HSV-1感染Vero細胞から抽出・精製して得たHSV-1DNAを鋳型としてPCRを行い準備した。gB-DNA断片と前出K-14を含むMCP-1領域を切出したプラスミドDNA断片(6993bp)をライゲーション・キットを用いて連結した。新たに得られたプラスミドの塩基配列確認、大腸菌に導入、培養、プラスミド回収を行い、作成したコンストラクトによるgBの細胞膜上での発現誘導を、transfectionを用いて確認した。K14プロモーターが発現する培養細胞(HeLa)にリポソームを用いてDNA断片をtransfection後mouse anti-gB抗体を用いたflow cytometryに供しgBの細胞表面への発現を確認した。発現細胞溶解液をImmunoprecipitation/Western blot法に供してgB発現を確認する予定である。さらにgB498-505配列-MHC class I複合体を認識するペンタマー分子を用いてマウス細胞における発現を確認する予定である。
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