リアルタイムPCRとFCMによる乳癌リンパ節癌微小転移の自動診断と予後の観察

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17591355
• Research Institution: Nippon Medical School
• Principal Investigator: 天神 敏博 日本医科大学, 医学部, 講師 (70217438)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 清水 一雄 日本医科大学, 大学院医学研究科, 教授 (20133449) ; 赤須 東樹 日本医科大学, 医学部, 助手 (30297866) ; 田中 久美 日本医科大学, 医学部, 助手 (50343603)
• Keywords: 乳癌 / CEA / サイトケラチン

Research Abstract

様々な癌培養癌細胞と正常リンパ球細胞や正常乳腺上皮培養細胞を種々の比率(1×10^<2〜8>個の検体細胞に対して癌細胞が1個)で混和し、さらにCEAとサイトケラチンに対して蛍光二重染色をおこなって蛍光顕微下で観察した。リンパ節より出来るだけ多く細胞を分離回収することはFCMの測定に重要であることから、「ハサミ分散法」を確立した。ハサミ分散法は眼科用ハサミを用いて組織をミンチ状に細切し、36度で1%コラギナーゼPBS数mlに懸濁させ1時間反応させた細胞を回収する方法が効率的であった。この方法において1cm^3の手術標本から1x10^6の細胞をかいしゅうできたが、改善し10^7から10^8個の細胞を回収する予定である。細胞膜透過性亢進は抗体やDNA染色色素が細胞内にアクセスし易くするための処理である。エタノール固定法が界面活性剤Triton X-100(TX)法より優れていた。また染色条件であるが、細胞に対してサイトケラチンとCEAは、36度で1時間染色することで、好ましい染色条件となった。これらの改善で染色時間は、短くなり、手術標本作成から観察可能の状態まで3時間以内で終了できることが可能となった。これらのことから細胞を蛍光標識した抗サイトケラチンモノクロナル抗体(17と19)とCEAモノクロナル抗体で二重染し、FCMにて測定した。これらの結果をX軸がDNA量、Y軸がサイトケラチン量、Z軸がCEAのドットプロット表示で測定・解析し、高い感度にてFCMに対して使用する染色条件を決定できた。