2007 Fiscal Year Annual Research Report
リアルタイムPCRとFCMによる乳癌リンパ節癌微小転移の自動診断と予後の観察
| Project/Area Number |
17591355
|
|---|
| Research Institution | Nippon medical school |
|---|
Principal Investigator |
天神 敏博 Nippon Medical School, 医学部, 准教授 (70217438)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
清水 一雄 日本医科大学, 医学部, 教授 (20133449)
赤須 東樹 日本医科大学, 医学部, 講師 (30297866)
田中 久美 日本医科大学, 医学部, 助手 (50343603)
|
|---|
| Keywords | 乳癌 / リンパ節癌微小転移 / Real-time(quantitative)PCR / フローサイトメトリー(FCM) |
|---|
| Research Abstract |
乳癌のリンパ節癌微小転移の有無は臨床的に重要な問題である。しかし病理学診断は連続切片の作成に膨大な時間と労働力を要すため検討すべき課題は多い。そこで定量化が可能なReal-time(quantitative)PCRとフローサイトメトリー(FCM)とを用いリンパ節癌微小転移を検討した。リンパ節癌微小転移の判定は病理学において診断されるが、リンパ節全体像の観察が困難なため、検出感度を低下させる。そこでリンパ節全体を測定するReal-time PCRとFCMを用いて極めて少量の癌を高感度に証明する診断法を確立する(0.2立方mm以下の微小癌転移の証明)。さらに迅速に測定できるFCMでリンパ節微小癌転移を2時間以内に判定し迅速診断法を確立する。
乳癌培養癌細胞MCF-7と正常リンパ節細胞を種々の比率で混和した。細胞を70%エタノールで-20℃、30分間固定し、PBSで遠心洗浄した後、FITC標識抗サイトケラチンモノクロナル抗体(MNF116)を室温で1時間、反応させた。PBSで遠心洗浄した後、DNA染色色素Propidium Iodide(PI)を含むPBSに細胞を再浮遊させ、フローサイトメトリーにて解析をした。横軸がPI蛍光(DNA量)、縦軸がFITC蛍光(サイトケラチン量)のドットプロット表示で測定した。乳癌培養細胞(SK-BR-3)と正常リンパ節細胞を種々の比率で混和しCEAをプライマーとし遺伝子発現量をReal-time PCR法にて解析した。固形組織のFCMに際して従来から用いられてきた細胞分散法や染色法が適用できた。2)症例毎に陰性対照を設ける必要があった。3)陰性対照におけるFITC蛍光の最も高い値を閾値として設定したところ、1×10^5個の正常細胞に対して癌細胞が1個であればFCMで癌の存在が判定できた。
|
