RNAi法を利用した変性促進遺伝子を抑制する椎間板細胞移植治療法の開発

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17591556
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: University of Toyama
• Principal Investigator: 川口 善治 富山大学, 附属病院, 講師 (00262527)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石原 裕和 富山大学, 附属病院, 講師 (30242499) ; 長田 龍介 富山大学, 附属病院, 助手 (40293310)
• Keywords: 椎間板 / 軟骨 / 三次元培養 / siRNA / adamts-4 / adamts-5 / cilp / 遺伝子治療

Research Abstract

in vitroにおける椎間板細胞内での軟骨変性促進遺伝子の抑制実験
(1)髄核細胞の摘出:ラビット10匹をネンブタールにて犠牲に供し、その後無菌的に脊柱を摘出し、椎間板の髄核組織を無菌的に単離した。DMEM 10%FBSにコラゲナーゼ、プロネースを入れて37度で組織が完全に溶解するまでincubationして、椎間板組織が完全に分解後に遠心、70uMのセルストレイナーを使用して細胞を単離した。
(2)髄核細胞のアルジネートビーズ内での三次元培養:摘出した髄核細胞を1.2%sodium alginateを用い、101mMCaCl_2溶液に滴下することでビーズ内に髄核細胞を包埋し、軟骨細胞分化培地(Takara)にて2週間3次元ビーズ内培養を行った。細胞の生存率、および形質を高めた後、以下の遺伝子導入に備えた。ビーズ培養後すぐに12well plateに細胞を撒いて以下のトランスフェクションの実験に利用した。髄核細胞は1wellあたり5×10^4の細胞数で撒いた。
(3)Knock down用dsRNAの作成:Knock down用のRNAは、これまでの文献的検討、adamts-4(aggrecanase 1)、adamts-5(aggrecanase 2)および、我々の同定した椎間板変性を促進すると考えられるcilpが適切と考え、これらの作製を行った。
(4)髄核細胞への遺伝子導入:現在リポフェクション法を用いて、rabbit adamts-4(aggrecanase 1)、adamts-5(aggrecanase 2)、cilp(cartilage intermediate layer protein)の遺伝子のmRNAに対するtarget sequence(2本鎖のRNA)の決定および、髄核細胞にトランスフェクションする条件を検討している。試薬はTakaraのtrans-it-TKOを用いて試薬の濃度、RNAの濃度、FBSの濃度、反応時間等の条件検討を現在行っている。最適な条件の決定は、rabbit adamts-4,5の発現をreal-time PCRを用いて行なう予定である。Real-time PCRはSyber greenを用いた系で行っている。standardを作成するためにまずrabbit髄核細胞より抽出したRNAを逆転写し、cDNAを合成した。そのcDNAをtemplateとしてadamts-4,5,およびcilpのprimerを作成して、PCRをTakara Ex taqを用いて施行した。PCR productをゲルで泳動してバンドを確認後にTA cloningを行った。そこで作成したプラスミドをreal-time用のstandardとして現在利用している。